BES1–KCS1调控模块通过BR信号与VLCFA生物合成之间的协调串扰抑制愈伤组织形成

《The Crop Journal》：The BES1–KCS1 regulatory module suppresses callus formation through coordinated crosstalk between BR signaling and VLCFA biosynthesis

　　

从体细胞诱导多能性愈伤组织是植物再生的关键步骤，对发育生物学、生物技术和作物遗传改良具有广泛意义。虽然生长素与细胞分裂素之间的关联已被确立为再生程序的核心调控因子，但其他植物激素的作用仍知之甚少。本研究中，研究人员阐明了一种机制，即油菜素甾醇（brassinosteroid, BR）信号转录因子BES1通过调节拟南芥和棉花中的极长链脂肪酸（very-long-chain fatty acid, VLCFA）生物合成来负调控愈伤组织形成。AtBES1直接结合AtKCS1启动子区域中的BR响应元件（BR response elements, BRREs），AtKCS1编码VLCFA生物合成中的限速酶，从而增强AtKCS1表达并提高内源VLCFA水平。利用Atkcs1和Ghkcs1敲除突变体进行的功能分析显示愈伤组织形成显著增加，证实了KCS1在此过程中的保守负调控作用。遗传分析进一步表明，KCS1在该通路中相对于BES1呈上位性作用。总之，这些发现揭示了一个未被表征的调控模块，其中BR信号与VLCFA代谢汇聚以抑制愈伤组织形成，为脂质-激素串扰调控植物再生过程中细胞多能性提供了新见解。

植物体细胞具有全能性，在适当条件下可再生出新的器官或完整植株，这是植物发育可塑性的重要体现。体外再生系统通常先在外源生长素诱导下形成具有多能性的愈伤组织（callus），再经分化培养基再生芽或根。然而，在许多作物中愈伤组织诱导效率低下，严重制约遗传转化和生物技术应用。已有研究确立了生长素和细胞分裂素在愈伤形成中的核心调控作用，但其他植物激素的贡献仍不清楚。极长链脂肪酸（very-long-chain fatty acid, VLCFA）已被暗示参与抑制愈伤形成，但其上游调控机制尚不明确。油菜素甾醇（brassinosteroid, BR）信号核心转录因子BES1与KCS1基因表达存在相关性，提示二者可能构成新的调控模块。为此，研究人员在拟南芥和棉花中系统研究了BES1与KCS1在愈伤形成中的功能及调控关系，揭示了BES1–KCS1模块通过BR信号与VLCFA生物合成协调串扰抑制愈伤组织形成的保守机制。该研究为理解脂质-激素串扰调控细胞多能性提供了新见解，并发表于《The Crop Journal》。

研究人员主要运用了CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建拟南芥AtKCS1及棉花GhBES1、GhKCS1、GhKCS10敲除突变体；通过农杆菌介导法获得GhBES1和GhKCS10过表达及RNA干涉（RNAi）材料；采用凝胶迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）检测BES1与KCS1启动子的直接结合；利用双荧光素酶报告系统验证BES1对KCS1转录的激活作用；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达；采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定VLCFA含量；并使用扫描电子显微镜观察愈伤组织形态。研究材料包括拟南芥Col-0及棉花品种ZM24和HM-1。

3.1 AtBES1通过直接激活AtKCS1负调控愈伤组织形成

研究人员利用AtBES1功能获得突变体bes1-D，发现其愈伤形成显著减少；EMSA证实AtBES1可直接结合AtKCS1启动子中的BR响应元件（BR response element, BRRE）；双荧光素酶报告实验表明AtBES1增强AtKCS1启动子活性。因此，AtBES1通过直接激活AtKCS1表达抑制愈伤形成。

3.2 AtKCS1在愈伤形成中作用于AtBES1下游

通过CRISPR/Cas9获得的多个AtKCS1敲除突变体均表现出愈伤形成增强。将Atkcs1-38与bes1-D杂交构建双突变体，发现Atkcs1-38可抑制bes1-D的愈伤减少表型，说明AtKCS1在遗传上位于AtBES1下游。

3.3 GhBES1在棉花中负调控愈伤组织形成

在棉花中，GhBES1过表达株系愈伤增殖率显著降低，而RNAi和CRISPR敲除株系愈伤形成显著增加。外源BR处理抑制野生型愈伤形成，但GhBES1-RNAi株系对BR处理不敏感，表明BR对愈伤积累的抑制作用依赖GhBES1。

3.4 GhBES1通过激活GhKCS1表达抑制愈伤形成

EMSA显示GhBES1可结合GhKCS1启动子中的E-box基序；双荧光素酶实验证实GhBES1激活GhKCS1转录。GhKCS1敲除突变体愈伤产量显著增加，表明GhBES1–GhKCS1模块在棉花中同样发挥抑制愈伤形成的作用。

3.5 GhKCS10作为GhBES1的另一靶基因负调控愈伤增殖

GhBES1也调控GhKCS10表达。GhKCS10过表达减少愈伤形成，RNAi和CRISPR敲除则增加愈伤鲜重，说明GhKCS10同样是愈伤形成的负调控因子。

讨论部分主要总结了三点。第一，BES1与BZR1在愈伤调控中发挥拮抗作用：BZR1通过激活ARF7/19促进愈伤形成，而BES1通过激活KCS1抑制愈伤形成，这种功能分化可能有助于植物精细调控再生能力。第二，多个KCS家族成员可能参与愈伤调控：单细胞转录组数据显示KCS1、KCS6、KCS10等在侧根原基起始相关细胞簇中高表达，提示KCS家族是愈伤调控网络的核心组分。第三，BR与VLCFA在愈伤调控中的功能具有保守性：BES1和KCS1在棉花与拟南芥间高度保守，BES1直接激活KCS1转录，KCS1在遗传上作用于BES1下游，表明该模块是整合BR信号与VLCFA生物合成的保守调控机制。此外，GC-MS测定显示atkcs1突变体中C₂₄H₄₈O₂和C₂₃H₄₆O₂等VLCFA含量显著降低，证实AtKCS1通过促进VLCFA积累调控愈伤形成。

研究结论部分翻译为：总之，研究结果揭示了一个拮抗性调控框架，其中BZR1–生长素信号促进愈伤组织形成，而BES1–VLCFA信号则抑制愈伤组织形成，从而微调细胞多能性和再生能力。该研究确立了BES1–KCS1模块作为连接BR信号与脂质代谢的中心节点，为愈伤组织形成和植物再生的协同调控提供了新的机制见解。