《Sci》：Revolutionizing Coffee Fermentation: Beyond Sensory Performance in Yeast Starter Culture Design—A Review
发酵如今已被认为远远超出了其在咖啡加工中去除粘液的传统作用；相反，它是一个生物化学上复杂、由微生物驱动的过程，对咖啡的风味、香气和杯测品质产生关键影响。酵母菌，包括Hanseniaspora、Pichia、Torulaspora、Candida、Meyerozyma和Saccharomyces，形成生态多样性的群落，其组成受加工方法、地理来源和环境条件的影响，不仅有助于风味发展，还有助于粘液降解、微生物稳定性以及抑制不良微生物。尽管由Saccharomyces和非Saccharomyces酵母配制的起始培养物经常改善了感官品质和过程控制，但发酵结果仍然高度依赖于菌株、剂量和工艺，因此生态优势性和果胶分解活性都不能一致地预测发酵性能或杯测品质。本综述识别了环境变异性、微生物竞争、粘液降解机制尚未完全阐明，以及生态优势性与技术功能性之间经常脱节的问题，作为可靠实施起始培养物的主要制约因素。总体而言，证据支持从感官驱动的菌株选择转向一个多维框架，该框架整合了生态适应性、胁迫耐受性、代谢稳定性、持久性、粘液降解能力以及在农场代表性非无菌条件下减轻缺陷的潜力。
1. 引言
咖啡是全球贸易最广泛、经济上最重要的农产品之一，最终饮品的感官品质在很大程度上由收获后的发酵步骤决定。发酵传统上仅被视为松动和去除羊皮纸周围粘液或果肉的手段；然而，现在它被认为是通过酵母菌、乳酸菌和丝状真菌的动态演替介导的风味和香气发展的关键且原则上可控的驱动因素。在这些微生物群中，酵母菌发挥着不成比例的重要功能作用。在日晒、水洗、半干式和厌氧处理系统中，Pichia、Hanseniaspora、Torulaspora、Candida、Meyerozyma和Saccharomyces等属被持续检测到，尽管它们的丰度和演替模式因地理来源、咖啡品种、加工方法和环境条件而异。这些群落不仅有助于发酵进程，还贡献于关键功能结果，包括粘液降解、微生物竞争、真菌抑制和风味化合物产生。然而，将这种生态学知识转化为可靠、可重复的发酵实践仍然具有挑战性。自发发酵仍然是行业常态，其固有不稳定性受果实成熟度、气候、农场卫生和地理影响，使得名义上相同的过程可能产生不一致甚至缺陷的咖啡品质。这种变异性因依赖内源微生物群落而加剧，这些群落的组成因农场、收获季节、气候条件和加工实践而异，而咖啡相关酵母的分类和功能多样性仍未完全解决，特定物种或菌株与特定感官结果之间的机制联系才刚刚开始被理解。总体上，这种变异性激发了人们对能够引导发酵朝向可预测和理想感官结果的选定微生物起始培养物的日益增长兴趣。
对酵母独特代谢能力的日益认识大大扩展了正在研究的候选微生物范围。Saccharomyces cerevisiae、Pichia fermentans、Pichia kluyveri、Torulaspora delbrueckii、Candida parapsilosis和Meyerozyma caribbica等物种已被证明能通过产生特定挥发性化合物和风味前体来产生理想的感官属性，包括花香、果香、焦糖、巧克力、蜂蜜和坚果香调。然而，仅产生理想感官特征的能力并不能保证酵母菌株作为起始培养物的适用性。成功的咖啡发酵依赖于更广泛的生态、生理和技术性状，使酵母菌株能够在咖啡加工高度动态的条件下建立、持久存在并一致地表现。尽管对受控发酵的兴趣日益增长，咖啡加工仍主要依赖自发和不受控的发酵，只有有限数量的研究报告了S. cerevisiae在工业规模上的应用。
虽然许多综述探讨了咖啡发酵的微生物生态学，但这些综述主要集中于分类多样性、发酵在风味形成中的作用或加工方法的比较分析，而非支撑起始培养物开发的实际标准。迄今为止，尚无综述专门综合了咖啡发酵酵母起始培养物选择和开发所需的生态、生理和技术标准——本综述旨在填补这一空白。首先，考察了与咖啡发酵相关的酵母多样性以及起始培养物的当前应用。随后，讨论了咖啡酵母起始培养物开发的主要挑战和未来前景。重点放在控制咖啡加工生态复杂环境中发酵性能的因素上，包括鉴定稳健菌株、粘液降解效率、整个发酵过程中的优势性和持久性，以及减少咖啡缺陷的能力。通过整合这些领域的当前知识，本综述提出了一个选择酵母起始培养物的框架，该框架能够在咖啡生产中提供一致的发酵性能、改进的过程控制和理想的感官结果。
2. 方法论
本综述综合了关于酵母菌（包括Hanseniaspora、Torulaspora、Candida、Meyerozyma、Pichia和Saccharomyces）在日晒（干法）、水洗（湿法）、半干式（蜜处理）及相关处理系统中咖啡发酵中的生态、代谢和技术作用的当前证据。相关文献从Scopus、Web of Science核心合集和PubMed检索，搜索延伸至2026年8月，对出版日期没有下限。在需要更广泛地定位咖啡发酵微生物学和起始培养物开发讨论时，纳入了基础和历史来源，并且一小部分非同行评审的学术材料（学位论文、会议论文集、专利）在符合下述资格标准时被考虑。
搜索词结合了分类学、工艺特异性、功能相关和技术相关的关键词。补充的定向搜索用于捕捉与酵母功能表征和菌株开发相关的新兴技术方法。合格来源包括同行评审的原创研究、综述和选定的权威书籍或书籍章节，涉及咖啡发酵期间的酵母多样性、生态优势性和演替；风味和香气活性代谢物的产生；粘液降解酶活性；发酵相关条件下的胁迫耐受性和竞争适应性；抑制腐败或产霉菌毒素生物；或起始培养物应用及其与感官和缺陷结果的关系。有限数量的学位论文、专利和会议论文集仅在它们提供通过同行评审渠道无法获得的直接相关数据时才被接纳。基因组和分子研究仅在发现直接与生理、代谢、生态或发酵性能结果相关时才被包括。临床研究、缺乏功能背景的仅分类学报告以及与发酵无关的工作被排除。
提取的数据涵盖物种身份、发酵系统（从浸没式到固态）、加工条件、生态优势性、酶产生、代谢活性、挥发性化合物生成、胁迫耐受性、缺陷关联以及报告的感官或技术结果。鉴于咖啡加工系统、酵母属和实验设计之间的显著异质性，采用了定性综合方法而非定量荟萃分析，以识别与起始培养物选择相关的重复功能模式和技术机会。
3. 咖啡发酵中的酵母多样性与起始培养物应用
发酵在咖啡加工中的作用在近几十年来发生了显著演变。历史上，发酵主要被视为促进水洗加工中脱果皮咖啡豆粘液去除的机械步骤。然而，广泛研究表明，发酵代表了一个复杂的生化过程，直接影响咖啡风味发展、香气形成和整体杯测品质。这一过程由酵母菌、细菌和丝状真菌之间的动态相互作用驱动，它们共同降解粘液成分、产生代谢物并改变咖啡豆的化学成分。最近使用同位素标记示踪剂证实了周围粘液中产生的微生物代谢物可能影响内部豆成分的长期假设，证明发酵衍生化合物有助于咖啡化学和感官潜力的变化。一个提出但尚未确认的发酵可能向咖啡引入香气的途径是通过酵母糖苷酶活性：一些菌株表现出强的β-葡萄糖苷酶活性，释放结合的香气前体如萜烯和C13-降异戊二烯类。这种糖苷酶活性通过水解结合香气前体中的糖苷键起作用，酶谱包括β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶，共同释放挥发性香气活性化合物，包括单萜醇如香叶醇和芳樟醇，以及2-苯乙醇，从其糖基化前体形式中释放出来。这种酶活性导致酯类、高级醇和脂肪酸浓度升高，支持将这些菌株归类为“风味酵母”。
与咖啡发酵相关的酵母群落高度多样，并根据加工方法、地理来源和环境条件而有显著差异。在日晒（干法）加工中，整个咖啡樱桃在不去除果皮的情况下干燥，使得源自果实表面和周围环境的微生物主导发酵。常驻微生物群受到果实成熟度、气候和农业实践的强烈影响。日晒发酵中经常检测到的酵母属包括Pichia、Debaryomyces、Candida、Arxula和Saccharomycopsis，酵母种群在发酵后期通常达到约106 CFU/g。其中，Arxula adeninivorans特别适应干法发酵环境，并已被实验证明具有耐热性和广泛的酶能力，包括果胶酶、纤维素酶、木糖苷酶和蛋白酶活性。然而，延长的干燥期和完整果实中的高营养可用性也增加了丝状真菌生长的风险，包括产生赭曲霉毒素A（OTA）的Aspergillus carbonarius。几种咖啡相关酵母，包括Debaryomyces hansenii、Wickerhamomyces anomalus（原Pichia anomala）、P. kluyveri和Hanseniaspora uvarum，已被实验证明对产生OTA的真菌具有拮抗活性，突显了它们对咖啡安全的潜在贡献。
在水洗加工中，脱果皮的咖啡豆在浸没条件下发酵，通常6-72小时，此时氧气可用性降低有利于发酵微生物。在此系统中检测到的主要酵母种群通常包括Pichia fermentans、P. kluyveri、P. guilliermondii、P. kudriavzevii、M. caribbica、Candida spp.、Torulaspora delbrueckii和H. uvarum，通常与乳酸菌（LAB）如Lactobacillus、Lactococcus和Pediococcus物种共存。尽管这些属经常被检测到，但它们的存在反映了生态发生而非已确认的功能贡献，且它们的相对丰度在农场和地理区域之间差异显著，种群水平通常从发酵开始时的约2-5 log CFU/g增加到36-48小时后的5-7 log CFU/g。这些变化表明咖啡发酵不仅受微生物存在控制，还受微生物与其周围环境之间生态相互作用的影响。
半干式（果肉日晒、蜜处理）加工代表了一个中间生态系统的特征，部分去除果肉暴露了粘液糖，同时保留了一些果实相关营养。这种环境有利于被检测为主要酵母属的生长，如Pichia、Torulaspora和Rhodotorula，说明了底物可用性和氧气暴露在塑造酵母演替中的重要性。
除了对风味形成的贡献外，咖啡相关酵母还执行重要的技术功能，这些功能与上述发生数据不同，已通过直接实验证据确立。一个主要功能是通过分泌水解酶进行粘液降解。几种物种，包括D. hansenii、W. anomalus、P. holstii、P. burtonii、P. guilliermondii和A. adeninivorans，已被实验证明产生果胶分解酶如多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶和果胶甲酯酶，促进果胶分解并改善加工过程中的粘液去除。此外，几种酵母已被证明通过竞争性排斥和拮抗相互作用抑制不良真菌（包括产生OTA的Aspergillus物种），从而有助于微生物稳定性。
咖啡果肉提供了一个营养丰富的环境，含有多糖、还原糖、蛋白质和有机化合物，支持微生物生长。在不同的加工方法中，酵母菌，特别是Pichia、Hanseniaspora、Torulaspora、Candida、Meyerozyma和Saccharomyces，始终代表主要微生物群。它们的演替受温度、pH、渗透压和营养可用性等非生物因素以及竞争、共栖和代谢合作等微生物相互作用的影响。通常，LAB通过酸化启动发酵，随后酵母增殖增强粘液降解并有助于形成与咖啡香气发展相关的乙醇、有机酸、酯类、高级醇、醛类和酮类。
地理来源进一步影响酵母多样性，创造了与特定咖啡产区相关的微生物“风土”。例如，巴西和厄瓜多尔咖啡经常与Candida和Pichia物种相关；墨西哥咖啡显示Cryptococcus和Pichia的较高流行率，而Saccharomyces物种很少被检测到，但有时在印度和巴西咖啡发酵系统中被报道。详细的物种水平演替模式、定量种群动态以及酵母在日晒、水洗和半干式咖啡发酵中的感官贡献，包括最新的宏基因组和多农场调查，已在最近的几篇综述中全面编目。更具体地说，除了基于培养的筛选外，宏基因组学和代谢组学方法为咖啡发酵酵母的功能表征提供了互补途径。宏基因组学能够直接从发酵环境进行不依赖培养的微生物群落组成和功能基因含量分析，捕获在标准实验室条件下难以分离或生长缓慢的分类群。一项最近的咖啡发酵样本鸟枪法宏基因组研究重建了宏基因组组装基因组，并使用系统发育基因组学框架以高置信度解析酵母分类学，鉴定Pichia kluyveri为最丰富和分布最广的物种，与Hanseniaspora、Torulaspora delbrueckii和Kurtzmaniella进化枝成员并列——这些分类群经常被经典依赖培养方法错误鉴定或解析不足。代谢组学分析反过来可以将群落结构与驱动风味结果的具体代谢物联系起来，帮助解决本综述中注意到的生态优势性与功能贡献之间的脱节。一项莫桑比克自发阿拉比卡发酵的宏基因组-代谢组学联合研究直接证明了这一点：途径重建将先前未报道的核心微生物组与Ehrlich途径和酯生物合成途径的激活联系起来，鉴定酵母菌为通过苯丙氨酸分解代谢产生苯乙醇的主要生产者，并将简单和脂肪酸酯的形成追溯到乙酰辅酶A衍生途径——直接将特定分类群与预测杯测花香和果香感官特征的挥发性化合物（芳樟醇、苯乙醇、乙酸乙酯）联系起来。合成生物学进一步将这些工具扩展到应用方向。尽管基因工程方法尚未专门应用于可可或咖啡起始培养物开发，但在其他发酵系统中建立的策略提供了一个模板：合成启动子工程以驱动果胶分解和其他发酵相关酶的过表达，异源生物合成途径的从头设计以增强风味活性代谢物的产生，以及基于CRISPR-Cas的基因组编辑以敲除或激活特定的胁迫耐受和代谢基因（例如，用于渗透胁迫适应的GPD1和GPP2，用于酸耐受的RecA和UvrA）。这种靶向修饰可以增强包括粘液降解酶活性、胁迫耐受性和代谢物输出在内的性状，但这些方法在咖啡发酵中仍未探索，并且需要权衡监管框架（例如，美国的GRAS状态、欧盟EFSA的合格安全推定）和消费者接受度，历史上消费者对非转基因经典育种方法的接受度高于直接基因改造。
理解这种微生物多样性为开发明确的起始培养物以改善发酵一致性和控制感官结果奠定了基础。与上述基于发生的观察不同，本节讨论的研究报告了通过直接接种试验进行实验测试的菌株。早期研究主要集中在S. cerevisiae，因为其强大的商业能力、发酵能力、环境稳健性和代谢咖啡糖的能力。在干法加工中，接种一致地增强了几个Coffea arabica品种的甜味、焦糖、巧克力、果香、花香、柑橘、坚果和辛辣属性，杯测分数通常在81.6到85.7分之间。
在半干式加工中，S. cerevisiae促进了焦糖化糖、柑橘、香蕉、红色水果、乳制品、蜂蜜、烘焙和坚果特征，大多数咖啡达到精品级分数（81-85分），尽管不同菌株间表现有所不同。在湿法发酵下，接种的咖啡发展了焦糖、红糖、蜂蜜、黄色水果、花香和柑橘香调，通常产生81到85分之间的杯测分数。在自诱导厌氧发酵中，S. cerevisiae进一步增加了风味复杂性，产生巧克力、焦糖、蜂蜜、坚果、可可、柑橘和成熟水果特征，同时保持精品级品质。总体而言，S. cerevisiae在所有加工方法中经常与改善的甜味和风味复杂性相关；然而，响应是菌株依赖性的。
研究随后扩展到非Saccharomyces酵母，因为它们能够产生多样的香气化合物并增强感官复杂性。Pichia fermentans在湿法发酵中表现出卓越潜力，产生柑橘、乳酸、花香、香草和太妃糖特征，杯测分数接近90分。其他物种，包括Pichia kluyveri、Pichia kudriavzevii、Torulaspora delbrueckii、Candida parapsilosis和Meyerozyma caribbica，也在不同加工系统中产生了理想的感官特征，包括果香、花香、焦糖、巧克力、蜂蜜、杏仁和乳制品香调。
更近期的策略已转向多菌株起始培养物和共接种方法以实现更大的风味复杂性。S. cerevisiae与T. delbrueckii、C. parapsilosis或P. kluyveri的组合增强了挥发性化合物的产生，包括与花香相关的苯乙醇和贡献果香特征的乙酸异戊酯。类似地，酵母-LAB组合，包括Pichia fermentans与Pediococcus物种以及S. cerevisiae与Lactobacillus plantarum或Leuconostoc mesenteroides，已改善了酸发展、粘液降解、挥发性产生和感官品质。
尽管酵母接种经常改善感官结果，但其效果并非普遍一致，一些研究报告了相对于自发发酵的中性结果。Taufik等人（2024）在干法咖啡发酵中检查了P. kudriavzevii与Klebsiella sp.组合作为起始培养物，发现杯测分数随接种剂量变化显著；在相同的1:10比例下，5%接种物产生的杯测分数低于精品级（78.38），而15%接种物产生了研究中记录的最高分数（84.25）。这表明接种百分比是感官结果的更关键决定因素，挑战了起始培养物设计的简单基于比例优化策略。类似地，Avallone等人（2002）报告，用果胶分解微生物接种咖啡发酵实现了过程的微生物控制，但相对于自发发酵并未加速粘液降解，也未改变最终饮品的感官品质。Elhalis等人（2021）观察到了类似模式，他们用两种已确认具有果胶分解活性的酵母H. uvarum和P. kudriavzevii接种湿法发酵；尽管如此，该研究未报告相对于自发对照的任何可测量的物理粘液降解加速，也未报告处理间降解时间的统计学显著差异。总之，这些研究表明，已确认的果胶分解能力，无论是在细菌还是酵母中，都不能可靠地转化为发酵条件下粘液分解的可测量加速，需要进一步研究。不一致的结果不仅限于接种试验：在一项依赖天然、未接种微生物群的温控发酵研究中，Pe?uela-Martínez等人（2023）报告了在15°C发酵的Cenicafé和Tabi品种中酵母种群较高，同时粘液降解延长和最终pH改变，但相对于自发发酵，杯测品质无显著差异。这些发现表明，微生物优势性、代谢物变化和过程控制不一定转化为优越或一致的感官结果，强调了起始培养物性能的菌株和系统依赖性。
前一部分回顾的日益增长的文献强调了酵母菌在咖啡发酵过程中的丰度和生态重要性，以及酵母接种在增强发酵控制、改善感官品质和提高过程一致性方面的巨大潜力。然而，许多可用证据是在实验室和中试规模条件下产生的，在这些条件下发酵参数可以更容易控制，实验可重复性更容易实现。因此，许多有前景的酵母菌株在商业咖啡生产中遇到的变异性和微生物复杂性条件下的性能仍未被充分理解。虽然许多酵母物种已证明有能力改善咖啡品质并产生理想的风味属性，但起始培养物的成功实施需要的不仅仅是良好的感官性能。候选菌株还必须具备使其能够在动态咖啡发酵环境中建立、竞争和有效运作的特征。这突显了需要一个更全面的评估框架，考虑支撑发酵成功的生态和技术性状。因此，下一节考察了开发稳健咖啡发酵酵母起始培养物相关的关键挑战和选择标准，特别强调控制发酵性能和过程可靠性的属性。
4. 咖啡发酵中的生态和过程驱动挑战
咖啡发酵受到几个独立、叠加的变异性来源的挑战：发酵模式、操作和环境异质性以及微生物竞争，以及多阶段下游加工。
4.1. 发酵模式的变异性
咖啡发酵的一个核心挑战在于其固有不稳定的操作模式。咖啡加工跨越从完全浸没到固态发酵的连续体，中间配置由特定加工条件控制。在经典浸没发酵中，液相构成主要介质，发酵衍生代谢物大部分保留在最终产品中。湿法咖啡加工大致类似于这一范式：在含水环境中发酵的粘液涂层豆经历双向扩散，可溶性化合物从豆中向外浸出到周围介质中，同时微生物代谢物渗透到豆基质中并重塑其化学成分。在光谱的另一端，固态发酵的特征是最少自由水，底物本身作为微生物活动的主要基质。日晒（干法）加工以及相当程度的半干式咖啡加工与此范式非常相似，因为发酵主要在有限水分条件下在果实表面发生。
4.2. 操作和环境异质性以及微生物竞争
复杂性的另一个维度源于在固有复杂的咖啡发酵环境中精确管理接种物生长以平衡果胶分解活性、香气发展和防止不良代谢物形成。在操作层面，咖啡加工涉及处理大量形成异质团的樱桃或脱果皮豆，在发酵容器中产生温度、氧气可用性和水分含量的大梯度。该过程通常在非无菌条件下进行，允许包括细菌、酵母菌和霉菌在内的内源微生物群落与引入的起始培养物动态相互作用，可能竞争过它们或改变其代谢活动。加之，外部环境变量如环境温度、湿度和气流很少保持一致，而人工处理通过不均匀的接种物分布和不一致的搅拌引入了进一步变异性。总的来说，这种因素组合可能对酵母生长动力学、代谢活性和芳香化合物的生物合成产生强烈影响。这一推断是从上述过程复杂性而非直接测量的结果得出的，它表明在大型发酵中可能难以实现一致的起始培养物性能和可重复的风味特征。
4.3. 下游加工和生化转化
发酵对咖啡品质的影响远远超出了微生物代谢的范围。相当比例的生化转化发生在固体豆基质内，随后通过一系列下游加工阶段（包括洗涤、干燥、环境储存、烘焙和冲泡）进行调节，每个阶段引入不同的化学和物理修饰，共同定义最终杯子的感官属性。在咖啡中，风味的关键决定因素主要源于发酵和烘焙过程中固体豆基质内的转化，而非通过蒸馏或逐步成熟进行浓缩。发酵期间的微生物活动产生并修饰一系列代谢物，包括有机酸、醇类和其他生物活性化合物，这些物质迁移到豆中并改变前体组成。这些前体随后在烘焙过程中通过美拉德反应、斯特雷克降解、焦糖化及相关热过程转化，产生冲泡咖啡特有的复杂挥发性和非挥发性香气化合物，强化了发酵衍生代谢物作为发酵食品系统中热风味发展的基础决定因素的更广泛原则。
5. 对起始培养物设计的启示
总的来说，这些生态和过程驱动的挑战为仔细选择和设计适合咖啡发酵的起始培养物创造了强烈需求。满足这一需求需要系统地评估菌株在不同环境条件下的性能，以及优化发酵条件，以充分利用酵母菌在咖啡生产中的功能潜力。异质发酵模式、非无菌加工环境、多阶段生化转化和可变下游条件的融合使得难以预测发酵期间的微生物活动最终如何转化为最终饮品的感官属性。作者认为，这些现实支持需要选择专门适应此类苛刻条件的起始培养物——经过严格筛选具有符合咖啡复杂发酵系统要求的理想生理和代谢性状，并能够减轻农场加工固有变异性的培养物。
5.1. 筛选稳健菌株
为了减轻与咖啡发酵相关的挑战，开发稳健的起始培养物仍然是一个核心要求。在食品和工业发酵系统中，微生物稳健性被定义为微生物在内部和外部扰动以及环境波动下维持稳定功能的能力。在本综述中，稳健性被视为复合、伞形属性，由三个可区分的属性支撑。胁迫耐受性是指菌株承受单个胁迫因子（如高乙醇或乙酸盐浓度、温度波动、低pH和渗透压）而不丧失活力的生理能力。生态适应性是指菌株在竞争性、非无菌咖啡发酵微生物组中，在存在内源细菌、酵母菌和霉菌的情况下建立、持久存在并保持代谢活跃的能力。代谢稳定性是指菌株在波动的过程条件下酶和生物合成活性的一致性，例如糖利用、果胶酶活性和香气前体转化。因此，稳健的起始菌株是结合了足够的胁迫耐受性、生态适应性和代谢稳定性，以在所述可变条件下可靠表现的菌株。实现这种稳健性需要多层面的方法，包括菌株改良、培养策略和过程层面干预。在菌株层面，代谢和进化工程方法已被应用于增强对高乙醇和乙酸盐水平以及温度、氧气和pH波动等关键胁迫因子的耐受性；然而，鉴于控制胁迫抗性的遗传网络的复杂性和相互关联性，改进通常是渐进的。因此，越来越多的重点放在选择固有适合咖啡发酵生态的稳健菌株，以及在生物质生产期间的生理调节上。
这些要求在咖啡发酵中尤其明显，酵母菌暴露于复杂的胁迫生态中。这种环境的特征是糖丰富粘液导致的高渗透压、酸性条件、温度波动、有限的氧气可用性以及与内源微生物群的激烈竞争。因此，菌株选择不仅必须考虑与发酵过程类型和内源微生物群的兼容性，还必须考虑在这些非无菌条件下维持酶和代谢活性的能力，这是粘液降解、缺陷减少和增强理想感官属性的基础。
相反，胁迫耐受性不足会使代谢活动失调，减少酶表达，导致前体转化不完全，或将代谢转向不良化合物。这可能表现为香气复杂性降低或在控制不良或高度竞争性发酵条件下形成异味。例如，P. guilliermondii在此类不利条件下与挥发性酚产生和相关感官缺陷有关。因此，为咖啡发酵选择酵母菌株必须优先考虑不仅固有的酶潜力，还要考虑在现实过程条件下维持代谢稳定性的能力。
咖啡收获固有季节性，豆成分因环境因素、农艺实践和植物生理而产生显著变化。这些波动不仅影响收获时间和产量，还影响豆的化学和微生物特征，最终影响发酵结果和杯测品质。这种季节性使候选起始培养物的系统评估复杂化。为克服这些限制，几项研究开发了咖啡果肉模拟培养基，在受控实验室条件下再现咖啡发酵的化学和营养条件。例如，de Melo Pereira等人（2014）配制了一种基于咖啡果肉的培养基，包含50%新鲜咖啡果肉提取物，补充柠檬酸果胶（2.0 g/L）、果糖和葡萄糖（各15.0 g/L）、酵母提取物（5.0 g/L）和大豆蛋白胨（5.0 g/L），pH 5.5，果肉提取物通过在高压灭菌前将200 g果肉在1 L无菌水中混合制备。Elhalis等人（2021a）后来开发了一种简化的合成版本，其中提取方法从混合改为将400 g果肉在1 L Milli-Q水中煮沸一小时然后过滤；糖浓度降至各10.0 g/L；省略了酵母提取物和大豆蛋白胨；pH降至4.7。这些实验室系统能够全年评估微生物生长和代谢性能，包括糖利用、有机酸产生、果胶酶活性和挥发性香气形成，通常通过HPLC和HS-SPME/GC-MS评估。性能可以通过额外层的过程控制进一步细化，包括接种物大小、发酵持续时间以及单培养、混合培养或抗微生物策略。这些筛选研究已鉴定了几种有前景的菌株，包括H. uvarum、P. kudriavzevii、P. fermentans、P. kluyveri、Saccharomyces sp.、C. ferigula、R. mucilaginosa、M. guilliermondii、W. anomalus和M. caribbica。随后对通过筛选评估的菌株进行的接种试验在实际咖啡发酵中显示了有前景的结果。在一项研究中，H. uvarum和P. kudriavzevii在接种发酵中占主导地位，种群达到约10.0 log CFU/mL，而自发对照为8.0 log CFU/mL。这种优势驱动了更快、更完全的糖利用和关键代谢物（甘油、醇类、醛类、酯类和有机酸）浓度高出2-3倍，转化为更高的杯测分数，特别是联合酵母接种为82.0，而对照为80.3（p < 0.05），以及从烤杏仁（H. uvarum）到麦芽和花生香调（P. kudriavzevii）的独特感官特征。第二项研究在湿法加工中将选定菌株P. fermentans单独应用于1.5 kg脱果皮豆时显示了类似模式。P. fermentans成功生长并显著增加了关键香气挥发性物质（乙醇、乙醛、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、2,3-丁二酮和己醛）相对于自发对照的产生（p < 0.05）。这转化为果香、黄油和发酵香气的感官分数显著提高，P. fermentans接种产生了最强烈的果香特征，与其升高的酯输出一致。总之，这两项研究表明，通过实验室筛选选择的菌株可以在真实发酵条件下作为起始培养物表现良好。然而，鉴于迄今为止评估的菌株和独立试验数量有限，这应被视为初步支持，而非实验室筛选作为田间性能通用代理的验证。
尽管具有实际价值，这些模拟培养基有显著局限性。咖啡果肉成分随品种、成熟度和种植区域变化很大，因此单一标准化配方无法捕捉农场遇到的全部成分范围。这些系统通常作为均质、充分混合且通常无菌或低接种量的培养物运行，不再现大型非无菌发酵特有的物理结构、温度和氧气梯度或异质内源微生物负荷。它们也不捕获洗涤、干燥和烘焙过程中发生的后续多阶段生化转化，这些转化可以进一步调节或掩盖发酵阶段效应。因此，咖啡果肉模拟培养基最好被视为菌株水平代谢和酶筛选的标准化初筛工具，而非农场发酵全部生态和过程复杂性的忠实替代品；在这些系统中显示前景的菌株在作为起始培养物候选物推进之前仍需要在中试或农场规模条件下确认。
据作者所知，尚未提出通过固态发酵（SSF）模拟自然干法加工条件的评估框架；然而，使用干燥生咖啡豆作为底物的现有研究表明，这种方法可以可行地适用于该目的。应该指出，以下两项研究最初都不是专门为SSF筛选框架设计的；两者在此作为方法学相关、实验验证的先例呈现，本综述提议可以适用于该目的。生咖啡豆提供了与采后加工条件直接相关的底物。Lee等人（2016）描述了一种早期、受控和无菌方法，其中生阿拉比卡豆再水化至约53%水分含量，然后在接种前在80°C蒸汽处理40分钟以减少天然微生物负荷，通过PDA琼脂平板确认。发酵在30°C下进行五天，标准化接种量为约104 CFU/g，之后通过蒸汽终止微生物活动，豆在受控条件下烘干和储存以供分析。Kwak等人（2018）后来展示了一种更开放、可及的变体，其中生咖啡豆浸没在水中再水化，接种酵母悬浮液，并在30°C发酵24小时，然后洗涤、干燥至约10%水分，并相对于未接种对照评估化学和感官变化，这是一种允许直接菌株比较而无需完整樱桃加工复杂性的快速筛选格式。本综述提出以下改进以加强这些方法专门用于SSF起始培养物筛选；它们是概念性建议，尚未在咖啡系统中进行实验验证。两种方法的一个方法学考虑是再水化或浸没过程中可溶性化合物（例如果糖、蔗糖）从豆基质中潜在浸出。通过底物强化补偿这种损失将更好地复制天然生化环境，建议未来改进。模拟外层粘液层，例如通过掺入干燥皮/粘液或人工替代品，也应考虑以提高模型相关性。本综述提出，生豆发酵模型可以有效适用于起始培养物评估，无菌和开放系统之间的选择取决于目标是分离接种菌株的生化贡献还是评估其在竞争性天然微生物组中的性能。
5.2. 粘液降解效率
粘液降解是所有咖啡加工路线中的关键步骤，无论发酵发生在具有完整果皮的整个樱桃中（如日晒干法加工），微生物通过结构破坏或扩散途径间接接触粘液，还是在脱果皮豆中（如水洗或半干式加工），粘液层直接暴露并易于微生物定殖和酶促分解。在所有情况下，这种降解是一个关键过程，主要针对构成豆外层的富含果胶物质的分解，由内源酶活性和微生物贡献的组合驱动，尽管各自的重要性仍有争议。即使在最近的multi-omics工作中，这一争论仍未解决：一项阿拉比卡发酵的鸟枪法宏基因组分析在发酵终点的主要微生物群中未检测到多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶或果胶酯酶的基因，导致作者假设粘液去除主要由内源豆酶而非微生物作用驱动。总体而言，咖啡粘液富含多糖，果胶约占其组成（湿基）的47%。碳水化合物部分由可发酵糖主导，包括蔗糖（33.15 mg·g-1）、葡萄糖（49.24 mg·g-1）和果糖（76.26 mg·g-1），而脂质（0.422 mg·g-1）和蛋白质（0.996 mg·g-1）仅以少量存在。鉴于这种富含碳水化合物的特征，任何能够分解复杂碳水化合物的过程在驱动咖啡发酵过程中的生化转化中起着关键作用。越来越多的证据强调了微生物活动的核心作用，要么通过产生有机酸降低pH并诱导粘液结构变化，要么通过直接酶促水解。这种酸化促进膨胀、破坏钙介导的交联并削弱多糖网络，导致粘液增溶，而非直接酶促解聚。同时，某些果胶分解酵母，包括Saccharomycopsis fibuligera、W. anomalus、Papiliotrema flavescens、P. kudriavzevii和H. uvarum，通过产生多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶和果胶甲酯酶等酶将果胶水解成可溶性化合物而做出贡献。然而，重要的是要注意，果胶分解能力不是固定的物种水平性状。即使在归属于同一物种的菌株中，也报告了酶产生和晕圈大小的显著分离株间变异性，这意味着仅分类学身份是功能粘液降解性能的不可靠预测因子。这强调了在选择起始培养物开发候选物时需要菌株水平而非物种水平的筛选，与下文描述的基于分离株的筛选方法一致。
总体而言，发酵过程中的粘液降解最好被理解为涉及内源酶、微生物代谢以及可变程度的外泌果胶分解酶的协同过程。理解这些机制导致多项研究将粘液降解能力作为选择咖啡发酵起始培养物的关键标准。因此，筛选和评估策略日益集中于酸化能力和果胶分解潜力等性状，确保选定的候选物能够在发酵过程中有效促进粘液分解。在此背景下，果胶分解分离株已成为有前景的起始培养物候选物，因为它们能够分泌促进粘液果胶酶促分解的胞外酶。在这些研究中，候选微生物通过在含有果胶或多聚半乳糖醛酸作为唯一碳源的矿物质培养基上进行平板测定筛选果胶分解活性，酶产生通过清晰晕圈形成指示。值得注意的是，这些平板测定通常在单个分离株水平进行，正是因为晕圈大小和酶滴度可以在同一物种的分离株之间显著不同，加强了菌株解析而非物种水平选择的理由。有前景的分离株随后通过在合成果胶培养基和咖啡果肉培养基中培养进行定量评估，然后使用标准生化测定测量关键果胶分解酶，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶和果胶甲酯酶。这种方法能够选择具有可证明的酶促粘液降解能力并有可能作为咖啡发酵起始培养物应用的菌株。
用于咖啡发酵酵母起始培养物的筛选框架仍在出现，迄今为止没有明确建立的方案基于酸化能力选择菌株，无论是通过直接有机酸产生还是通过对内源产酸微生物的间接影响。在此背景下，酵母驱动系统中的酸化可能不是主要代谢性状，而是可能通过调节微生物群落间接产生，包括刺激乳酸菌（LAB）活性和相关有机酸产生。几项咖啡发酵研究报告了接种酵母与乳酸菌之间的积极生态相互作用。接种P. fermentans、P. kudriavzevii和H. uvarum等酵母与增强的LAB活性、增加的乳酸产生或有利于LAB生长的微生物演替相关，表明这些微生物群在咖啡发酵期间存在潜在的交叉喂养和合作相互作用。从用于咖啡发酵的其他微生物群研究中可以获得有价值的方法学见解，特别是基于LAB的起始培养物，通常筛选其快速酸化发酵环境并调节微生物活动的能力，从而通过发酵基质中的生化变化而非直接果胶分解水解间接促进粘液降解。更具体地说，咖啡发酵的进展和完成可以使用传统和分析指标进行评估。粘液降解历史上通过手指摩擦评估，摩擦豆以检测从粘滑到粗糙质地的转变，尽管这种方法主观且依赖操作者。一个更实用和客观的指标是酸化，反映在发酵过程中pH下降。达到pH约5表明发酵将在约2小时内完成，而pH约4表明过度发酵。因此，pH低于4.0被广泛认为是可靠终点，因为它反映了足够的有机酸积累，主要来自乳酸产生。在自发发酵下，该阈值通常仅在约24小时后达到；然而，当用选定的LAB起始培养物（如Lactiplantibacillus plantarum）接种发酵时，观察到有效的糖消耗和快速酸化，并将这一发酵窗口缩短至仅10小时。虽然pH轨迹和残余糖含量提供了发酵进展的实际标记，但粘液降解的确切生化机制仍未完全解决。显微镜检查表明，粘液从羊皮纸层脱离通过第一层粘液细胞与下层细胞基底附着位点的局部壁破裂发生。然而，这种相互作用的精确
