《Current Research in Food Science》：Cell surface localization of receptors considered nonfunctional and orphan bitter taste receptors
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尽管为约25种推定功能性人类苦味受体鉴定苦味激动剂已付出大量努力，仍有四种受体至今仍为孤儿受体。这些受体激动剂鉴定困难究竟是源于与功能性异源表达相关的技术问题，还是由于缺乏合适的激活物，目前尚不清楚。一些被认为无功能的苦味受体变异体也存在类似问题。部分研究人员
尽管为约25种推定功能性人类苦味受体鉴定苦味激动剂已付出大量努力，仍有四种受体至今仍为孤儿受体。这些受体激动剂鉴定困难究竟是源于与功能性异源表达相关的技术问题，还是由于缺乏合适的激活物，目前尚不清楚。一些被认为无功能的苦味受体变异体也存在类似问题。部分研究人员认为这些变异体无功能，另一些则推测其激动剂特异性可能已转向尚未知晓的苦味化合物。在异源功能测定中，高效的细胞表面定位通常是经典TAS2R信号转导所必需的，也是决定受体反应性的重要因素。为解决异源表达测定中缺乏反应性的问题，研究人员使用本实验室建立的HiBiT蛋白标记系统，在活体哺乳动物细胞中定量评估了这些受体的细胞表面定位。将HiBiT标记的推定无功能受体和孤儿受体在HEK 293T-Gα16gust44细胞中表达，并使用膜不可渗透的检测试剂进行发光测量。结果显示，所有四种孤儿受体TAS2R19、-R42、-R45和-R60，以及推定无功能的TAS2R9和TAS2R38受体变异体均存在于细胞表面，尽管水平差异显著。免疫荧光实验证实了这些结果。研究人员得出结论：某些孤儿苦味受体在异源细胞中未表现出明显的运输或错误折叠问题，提示存在尚未发现的苦味激活物，尤其是TAS2R19和TAS2R60这两种表现出显著细胞表面定位的受体。
人类苦味感知是避免摄入潜在有毒物质的重要机制。苦味由约25种味觉2型受体（taste 2 receptors, TAS2Rs）介导，该家族属于G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs），可识别数百种结构多样的苦味化合物。在26种被视为功能性的人TAS2Rs中，已有22种鉴定出苦味激动剂，但TAS2R19、TAS2R42、TAS2R45和TAS2R60始终未被去孤儿化；同时，TAS2R9和TAS2R38存在推定无功能变异体，即TAS2R9-187V和TAS2R38-AVI。这些受体缺乏反应性可能是因为异源表达中的生物合成、折叠、运输缺陷，也可能是由于配体特异性改变或尚无合适激活物。高效的细胞表面定位是经典TAS2R信号转导和受体反应性的前提，因此评估细胞表面定位有助于区分上述可能性。Praveen Kumar和Maik Behrens在《Current Research in Food Science》发表的研究采用本实验室建立的HiBiT蛋白标记系统，定量检测活细胞表面这些受体的存在情况，以判断其是否具备响应潜能。
研究的关键技术包括：将HiBiT（一种11氨基酸肽标签）融合至sst3-输出标签（sst3-export tag，大鼠生长抑素受体亚型3前45个氨基酸）的氨基端，在HEK293T-Gα16gust44细胞中瞬时表达HiBiT标记的受体构建体；使用膜不可渗透的HiBiT细胞外检测试剂定量细胞表面受体，使用HiBiT裂解检测试剂测定总受体量；通过荧光成像板读取仪（fluorometric imaging plate reader, FLIPR）进行发光和荧光测量；用抗HiBiT活细胞免疫细胞化学和共聚焦显微镜验证定位。该研究使用培养细胞模型，未涉及人群队列样本。
### 3.1 将HiBiT序列融合到非功能性TAS2R变异体可实现对其细胞表面定位的研究
通过钙成像功能实验，100 μM的PROP可激活TAS2R38-PAV和TAS2R38M，但不能激活TAS2R38-AVI和TAS2R38NTM；2 mM氧氟沙星可激活TAS2R9-187A和TAS2R9M，但不能激活TAS2R9-187V和TAS2R9NTM，说明HiBiT修饰未根本改变受体的功能表型。发光实验显示，所有含HiBiT的受体均产生高于阴性对照的细胞表面信号；TAS2R38M信号强于TAS2R38NTM，TAS2R9M略强于TAS2R9NTM，表明推定无功能变异体也能到达细胞表面但丰度较低。
### 3.2 HiBiT标记的孤儿苦味受体的细胞表面定位
对TAS2R19M、TAS2R42M、TAS2R45M和TAS2R60M进行HiBiT细胞外发光检测，结果显示所有孤儿受体均可产生可检测的细胞表面信号，但水平差异明显。其中TAS2R19M信号最强，TAS2R45M信号最弱，提示TAS2R45的细胞表面定位较差。
### 3.3 到达细胞表面的TAS2R精确比例
通过比较HiBiT裂解检测得到的总受体量与细胞外检测得到的表面受体量，计算各受体的表观细胞表面比例：TAS2R9M为17%，TAS2R9NTM为12%，TAS2R38M为17%，TAS2R38NTM为6%，TAS2R42M为3%，TAS2R45M为6%，TAS2R19M为83%，TAS2R60M为9%，TAS2R14M为16%。TAS2R60总表达量最高，但细胞表面比例仅为9%；TAS2R42和TAS2R45表面比例较低；TAS2R19表面比例最高，且表面绝对量突出。
### 3.4 HiBiT标记TAS2R的免疫细胞化学检测
利用抗HiBiT活细胞染色，TAS2
