《Environmental Challenges》：Integrating culture-based isolation and Illumina metabarcoding to characterise rhizospheric fungal diversity associated with
Bergenia ciliata across geographically distinct sites in the Himalaya
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药用植物根际是一个动态的微生物热点区域，栖息着分类学和功能上多样的真菌群落，这些群落通过复杂的共生、腐生和致病性相互作用驱动养分循环、有机物分解、土壤生物地球化学过程以及植物健康。本研究采用培养依赖性分离与Illumina MiSeq宏条形码相结合的综合方法，
药用植物根际是一个动态的微生物热点区域，栖息着分类学和功能上多样的真菌群落，这些群落通过复杂的共生、腐生和致病性相互作用驱动养分循环、有机物分解、土壤生物地球化学过程以及植物健康。本研究采用培养依赖性分离与Illumina MiSeq宏条形码相结合的综合方法，对克什米尔喜马拉雅三个不同采样点岩白菜（Bergenia ciliata）根际真菌多样性进行了全面调查。两种方法均揭示了采样点间真菌群落的清晰空间结构，表明不同位点间真菌群落组成存在位点相关变异。尽管本研究未直接量化环境变量，但观察到的群落更替和推定功能类群组成的差异表明，位点相关条件可能对观察到的真菌群落结构变异有所贡献。宏条形码分析揭示了显著更高的分类多样性，包括稀有和不可培养类群，并鉴定出以担子菌门（Basidiomycota）为主导的真菌群落，其中节担菌属（Wallemia）为各采样点最丰富的属。相比之下，培养分离法仅捕获了该多样性的一个子集，主要为快速生长的丝状真菌，如曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）和木霉属（Trichoderma），这强调了两种方法固有的互补性和偏差。来自宏条形码和培养法的整合α多样性与β多样性分析揭示了与岩白菜相关的根际真菌群落存在清晰的位点特异性变异，其中古尔马格（Gulmarg）的群落组成独特，而相对于阿哈尔巴尔（Aharbal）和辛森山口（Sinthan Pass）则表现出中间组成特征。基于FUNGuild的功能注释表明，推定腐生营养型（putative saprotrophs）是所有采样点占优势的预测营养类群，推定病养–腐生型（putative pathotroph–saprotroph）类群也有显著贡献。尽管Illumina宏条形码显示三个采样点间预测营养类群的分布大体相似，但培养依赖性分析显示出更大的位点相关变异以及更高的推定共生营养型和多功能类群的代表性。这些互补方法共同提供了对岩白菜根际真菌群落潜在功能组成的更全面评估。总体而言，整合培养依赖性与宏条形码方法提高了对根际真菌多样性和推定功能类群组成的分辨率，展示了真菌群落清晰的位点相关变异，并为未来喜马拉雅药用植物真菌群落生态学和植物–微生物互作研究奠定了基础。
**论文解读：整合培养分离与Illumina宏条形码表征喜马拉雅岩白菜根际真菌多样性**
**一、研究背景与问题**
喜马拉雅山脉以短距离内显著的环境异质性著称，海拔梯度常伴随气候条件、植被特征、土壤理化性质及养分有效性的变化，这些因素共同影响微生物多样性与群落组装。药用植物根际是动态的微生物热点区域，其根际微生物群落在养分循环、有机物分解、土壤生物地球化学过程以及植物健康中发挥关键作用，且越来越多的证据表明药用植物的药效与其根际微生物组的多样性和功能潜力密切相关。岩白菜（*Bergenia ciliata* (Haw.) Sternb.）是虎耳草科（Saxifragaceae）多年生草本植物，在阿育吠陀和尤纳尼传统医学体系中占据重要地位，广泛用于治疗尿石症、胃肠疾病、呼吸道疾病和炎症等。其药效归因于岩白菜素、糖苷、儿茶素、没食子酸等生物活性植化成分。岩白菜生长在温度波动、养分限制和多重生化胁迫的高海拔脆弱环境中，其生存与适应往往依赖根际微生物介导的养分增溶、有机物分解和非生物胁迫耐受。然而，尽管具有重要的生态和药用意义，该物种的根际真菌群落，特别是在跨越不同海拔的喜马拉雅位点，仍缺乏系统表征。
传统上，根际真菌研究主要依赖培养依赖性方法，但该方法只能回收土壤真菌群落的一小部分，许多生长缓慢、生态特化或难以在标准实验室条件下培养的类群无法被获取。相比之下，基于ITS区域的高通量测序技术——Illumina MiSeq宏条形码能够直接从环境DNA中实现真菌群落的非培养依赖性剖析，提供更广泛的分类覆盖，包括稀有和低丰度类群。然而，宏条形码主要表征群落组成和分类多样性，从序列数据推断的功能类群注释仍属推定性质。因此，整合培养依赖性与非培养依赖性方法可提供根际真菌多样性与功能潜力的互补认知。本研究假设：(i) 培养依赖性与宏条形码方法回收截然不同但互补的真菌多样性组分；(ii) 真菌群落组成和多样性随采样位点变化；(iii) 分类与推定营养类群结构在不同位点间存在差异。基于此，研究人员对克什米尔喜马拉雅三个采样点的岩白菜根际真菌群落开展了整合表征研究。
**二、关键技术方法**
本研究整合了培养依赖性分离与Illumina MiSeq宏条形码两种方法。培养分离采用系列稀释涂布平板法，使用添加链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基分离可培养真菌，并结合形态学与分子鉴定。宏条形码分析针对真菌ITS区域进行PCR扩增，在Illumina MiSeq平台进行双端测序，使用Kraken分类器对UNITE数据库进行直接分类学注释。功能类群注释采用FUNGuild数据库基于分类学身份进行推定营养类型归属。样本采集自印度查谟和克什米尔邦克什米尔河谷三个不同海拔位点的岩白菜根际土壤，包括阿哈尔巴尔（Aharbal，低海拔2231 m a.s.l.）、古尔马格（Gulmarg，中海拔2745 m a.s.l.）和辛森山口（Sinthan Pass，高海拔3277 m a.s.l.）。测序原始数据已提交NCBI SRA（BioProject PRJNA1513406）。
**三、研究结果**
**3.1 根际真菌多样性与群落组成**
**3.1.1 Illumina测序宏条形码方法**：宏条形码测序共获得约280万高质量双端序列，注释到6门、25纲、66目、149科和260属，其中635个真菌类群获得物种水平分类学注释。担子菌门（Basidiomycota）为优势门，占各采样点序列的52.25%~68.60%。在科水平，Wallemiaceae为最丰富科（占50.95%~68.39%），其次为曲霉科（Aspergillaceae）。在属水平，节担菌属（*Wallemia*）和青霉属（*Penicillium*）在全部采样点占主导地位，*Wallemia*占50.95%~68.39%。α多样性分析显示，阿哈尔巴尔具有最高的Chao1丰富度（100.21）和Fisher's alpha（9.97）但最低的Shannon（1.07）和Simpson（0.49）指数，表明优势类群（特别是*Wallemia*）的主导性更强；古尔马格显示出最高的Shannon（1.64）和Simpson（0.65）多样性；辛森山口则具有最低的估计丰富度。热图分析与多元分析（PCA和层次聚类）均揭示了清晰的位点特异性群落结构，古尔马格与辛森山口的组成相似性高于两者与阿哈尔巴尔的相似性。
**3.1.2 培养依赖性方法**：培养分离法回收了37种真菌，隶属17属，主要为子囊菌门（Ascomycota，28种）和毛霉门（Mucoromycota，5种）。优势属包括曲霉属（*Aspergillus*）、镰刀菌属（*Fusarium*）、木霉属（*Trichoderma*）、青霉属（*Penicillium*）和链格孢属（*Alternaria*）。物种丰富度以古尔马格最高（22种），其次为阿哈尔巴尔（21种）和辛森山口（17种）。相对丰度分析显示不同采样点的优势种有所不同。α多样性分析（Shannon指数、Simpson指数和Pielou均匀度指数）显示中等程度的位点间变异，古尔马格多样性最高（H′=2.98）。Bray–Curtis相异度（0.49~0.58）和PCA分析表明位点间存在中高度组成差异，其中阿哈尔巴尔与辛森山口差异最大，古尔马格处于中间位置且与两站点均较相似。
**3.1.3 跨采样点稳定检出的真菌类群**：宏条形码数据集的韦恩图分析显示，260个真菌类群中有65个（25.0%）为三个位点所共有。培养依赖性数据集鉴定出6种在所有采样点稳定分离的物种：黄曲霉（*Aspergillus flavus*）、黑曲霉（*Aspergillus niger*）、高山被孢霉（*Mucor hiemalis*）、淡紫拟青霉（*Paecilomyces lilacinus*）、扩展青霉（*Penicillium expansum*）和深绿木霉（*Trichoderma atroviride*）。培养法稳定回收的类群仅是宏条形码检测到的更广泛真菌群落的子集，表明两种方法在表征根际真菌群落方面具有互补性。
**3.1.4 培养依赖性与宏条形码方法的比较分析**：两数据集间的韦恩图比较显示部分类群重叠。阿哈尔巴尔位点有10个真菌类群被两种方法共同检出，古尔马格为8个（重叠最少），辛森山口为11个（重叠最多）。两种方法在每个位点均检出了方法特有的类群，进一步证实了它们捕获真菌群落不同组分的能力。
**3.2 隐秘与稀有真菌类群**：宏条形码共生成635个真菌类群（260属），远超培养法获得的37种（17属）。担子菌门成员（尤其是*Wallemia*）在宏条形码数据集中占主导地位，但在培养结果中代表性极低。多个低丰度和类酵母属（包括念珠菌属*Candida*、梅氏酵母属*Meyerozyma*和毕赤酵母属*Pichia*）仅通过宏条形码检出。相比之下，培养法主要回收了丝状子囊菌。这些观察表明两种方法在检出真菌类群上存在显著差异。
**3.3 功能类群分布**
**3.3.1 宏条形码方法的功能类群分析**：基于FUNGuild的功能注释显示，三个采样点的推定营养类群分布总体相似。推定腐生营养型为优势预测营养类群，占注释群落的45.3%~48.2%；推定病养–腐生型为第二大类群（18.4%~19.5%）；推定病养型占12.1%~14.0%；推定共生营养型仅占2.1%~3.2%。此外，13.1%~16.6%的类群未被功能注释，反映了现有参考数据库对许多真菌谱系生态注释的局限性。
**3.3.2 培养依赖性方法的功能类群分析**：FUNGuild分析显示三个采样点间预测营养类群分布存在变异。推定病养型在阿哈尔巴尔（24.11%）和古尔马格（27.31%）为最大预测营养类群，而推定共生营养型在辛森山口最为丰富（23.50%）。推定病养–腐生型占各采样点注释分离物的20.19%~30.74%。多功能类群如推定病养–共生营养型和病养–腐生–共生营养型也有一定比例贡献。
**3.3.3 功能类群谱比较**：比较分析显示宏条形码与培养依赖数据集间的推定营养类群组成存在明显差异。宏条形码数据集中推定腐生营养型占主导（45.3%~48.2%），而培养分离物中仅占4.26%；推定共生营养型则呈现相反模式，在宏条形码数据集中仅占2.1%~3.2%，但在辛森山口的培养分离物中达23.5%。这些差异表明两种方法回收了不同比例的推定营养类群，提供了对岩白菜根际真菌群落营养结构的互补描述。
**四、讨论总结与研究结论**
讨论部分综合评估了整合方法的优势，指出宏条形码恢复了635个类群，远超培养法的37种，这反映了公认的培养偏差，即实验室条件偏好快速生长和竞争性主导的类群；而宏条形码能检测稀有、生长缓慢、休眠及不可培养类群。*Wallemia*属在所有采样点的优势地位可能与其显著的环境胁迫耐受性有关，包括适应低水可用性、高渗透压、温度波动和营养限制，其在喜马拉雅根际的稳定存在凸显了培养非依赖方法在表征环境适应类群中的价值。空间变异分析表明，群落组成差异应视为位点相关变异而非直接的海拔效应，因为每个海拔水平仅代表一个采样点，海拔与其他位点特定因素（植被、土壤性质、气候和地理位置）无法分离。共享类群分析表明，*Wallemia*、*Penicillium*、*Aspergillus*和*Trichoderma*等属的广泛生态适应性和持久性使其能在不同位点稳定存在。功能类群分析显示，推定腐生营养型占主导，这与根际环境中真菌分解作用对有机底物转化和循环的潜在重要性一致，但FUNGuild注释应视为推定生态注释而非功能活性的直接证据。培养法与宏条形码在功能类群代表性上的差异反映了两种方法固有的检测偏差和互补性。
研究结论指出，本研究提供了克什米尔喜马拉雅三个地理上不同位点岩白菜根际真菌群落的首次整合表征。两种方法揭示了真菌群落的共有和方法特有组分，表明单独采用任何一种方法均无法捕获根际真菌多样性的全貌。宏条形码检测到更广泛的分类谱系，而培养分离法提供了可供后续生态和生物技术评估的活体真菌分离物。真菌群落组成和营养类群谱在不同位点间存在差异，特别是*Wallemia*的高代表性和主要真菌类群相对丰度的变异，表明存在显著的位点相关群落结构差异。这些模式应解释为跨越海拔梯度的地理上不同位点间的变异，而非直接海拔效应的证据。FUNGuild分析表明推定腐生营养型为优势预测营养类别，同时存在推定病养型、共生营养型和多功能类群，暗示根际真菌群落具有多样的潜在生态策略。整合方法的互补结果进一步证明了结合培养依赖性和基于序列的方法对于根际真菌表征的重要性。总体而言，岩白菜根际栖息着包含广泛检出和位点相关类群的多样真菌群落，本研究为克什米尔喜马拉雅岩白菜根际真菌多样性和推定营养结构建立了基线描述。培养获得的真菌分离物，特别是具有已知植物有益或拮抗特性的类群，为未来植物促生、养分活化、生物防治和生物活性代谢产物等实验研究提供了资源。未来需纳入每个海拔的多个独立采样位点、土壤和环境变量的直接测定以及真菌功能的实验评估，以确定观察到的群落格局的环境驱动因子和生态机制，最终为喜马拉雅山地生态系统中岩白菜及其他药用植物的可持续栽培、保护和利用提供微生物组知情的方法。
