探索4-甲基苯基亚甲基樟脑（4-Methylbenzylidene camphor）引发的发育性神经毒性的潜在靶点和机制：整合网络毒理学与斑马鱼实验验证方法

《Environmental Pollution》：Exploring potential targets and mechanisms of 4-Methylbenzylidene camphor-induced developmental neurotoxicity: Integration of network toxicology and zebrafish experimental validation

　　

摘要

4-甲基苯基乙烯樟脑（4-MBC）作为一种广泛使用的有机紫外线过滤剂和新兴的环境污染物，在水生生态系统和人体组织中积累，但其对发育的神经毒性机制尚不清楚。本研究结合了网络毒理学、分子对接和动态模拟、斑马鱼实验、剂量依赖性转录组学以及不良结局途径（AOP）框架，来阐明4-MBC的神经毒性机制。网络毒理学确定了150个潜在靶点和10个核心靶点（如BDNF、DLG4、EGF等），富集分析显示谷氨酸突触信号传导、MAPK通路和DNA复制可能是关键通路。分子对接和动态模拟预测4-MBC能够与核心靶点（如DLG4、GRIN2B）稳定结合。暴露于4-MBC（浓度分别为1、10、100和1000 μg/L）的斑马鱼表现出浓度依赖性的发育畸形、孵化率降低以及幼体运动能力受到抑制。转录组学分析发现了311个剂量响应基因，并揭示出谷氨酸传递紊乱、MAPK活性失调和DNA复制缺陷可能是潜在的驱动因素。RT-qPCR进一步验证了在100和1000 μg/L浓度下代表性基因的剂量依赖性转录变化：突触基因bdnf和dlg4表达下调，而神经发育标志基因ngn1和shha表达上调。基于AOP的生物信息学分析进一步指出DNA修复受损可能是触发神经前体细胞凋亡和随后生长抑制现象的潜在节点。总体而言，这些发现提出了一个工作模型，即4-MBC通过破坏谷氨酸突触、激活MAPK信号传导并干扰DNA复制来诱导发育神经毒性，尽管这一级联反应的直接功能验证仍有必要，但这为环境和人类健康风险评估提供了见解。

引言

有机紫外线过滤剂（OUVFs）被广泛添加到化妆品中，可以吸收UVA/UVB辐射，并通过生活污水和地表径流持续进入水生生态系统（Langford等人，2015年；Wnuk等人，2017年）。这些持久的生物累积污染物在食物链中可能会放大，对水生生物构成潜在危害（Brausch和Rand，2011年；Juliano和Magrini，2017年）。4-甲基苯基乙烯樟脑（4-MBC）作为一种具有选择性吸收UVB特性的有机樟脑衍生物，因其出色的光稳定性和可逆异构化特性而受到高度重视（Tarras-Wahlberg等人，1999年；Wolf，2009年）。传统的污水处理过程对去除4-MBC的效果有限，去除效率在38%到77%之间（Tsui等人，2014年）。具体而言，4-MBC在地表水中的浓度可达1.14 μg/L，在污水处理厂排放水中为2.7 μg/L，在污水处理厂进水中共为6.5 μg/L（Poiger，2005年；Rodil等人，2009年）。4-MBC的高亲脂性促进了其在生物体内的积累（Liang等人，2020年），在水生生物组织中的脂质分数中的浓度可高达1800 ng/g（Buser等人，2006年；Peng等人，2017年）。与在水生生物体内的累积类似，4-MBC也可通过饮用水中的摄入在人体内积累，可能对人类健康产生不良影响（Frederiksen等人，2021年；Krause等人，2017年）。例如，已有研究表明4-MBC能够促进乳腺癌细胞的增殖（Schlumpf等人，2004年）。此外，4-MBC还可引起生殖和甲状腺内分泌紊乱，并调节激素受体基因的mRNA表达水平（Durrer等人，2005年）。最新研究还表明，4-MBC对神经退行性疾病有广泛影响，特别是在阿尔茨海默病和帕金森病中表现出潜在的神经毒性（Broniowska等人，2016年）。然而，目前的大多数研究仅关注4-MBC对哺乳动物细胞层面的内分泌和神经退行性风险，而其在实际环境浓度下对水生生物的神经发育危害仍不充分了解。

虽然4-MBC对人类健康构成了严重的内分泌和神经毒性威胁，但它也会在水生生物中引发多种毒性反应。例如，4-MBC会损害斑马鱼胚胎中神经元和肌肉的发育（Li等人，2016年）以及心脏的发育（Quintaneiro等人，2019年），并导致Solea senegalensis幼体的游泳行为异常以及乙酰胆碱酯酶（AChE）和乳酸脱氢酶（LDH）活性的改变（Araujo等人，2018年）。Wang等人指出，4-MBC在脊椎动物和无脊椎动物中都表现出干扰内分泌系统的特性，从而干扰繁殖过程（Wang等人，2016年）。此外，4-MBC还会在桡足类Tigriopus japonicus中引发氧化应激和细胞凋亡，导致发育和生殖毒性，甚至死亡（Chen等人，2018年）。然而，在环境相关浓度下，4-MBC引起的神经毒性的分子靶点和通路仍不明确，尤其是在水生脊椎动物中。

传统的毒理学方法无法完全阐释复杂的毒性机制，这推动了网络毒理学作为一种创新范式的发展（Dai等人，2020年）。然而，仅依靠网络毒理学预测容易导致假阳性结果（Qu等人，2025年）。作为一种可靠的体内模型，斑马鱼（Danio rerio）由于其透明的胚胎和高的人类遗传同源性，适合用于发育神经毒性研究（Bradford等人，2017年；Fitzgerald等人，2021年）。同时，剂量依赖性转录组学结合基准剂量（BMD）模型可以筛选与化学暴露剂量密切相关的剂量响应基因（DRGs）（Pan等人，2025年；Larras等人，2018年）。基于上述分析工具，不良结局途径（AOP）框架进一步将毒性机制从分子变化系统化为从分子起始事件（MIEs）到不良结局（AOs）的连续级联过程（Ankley等人，2010年）。结合斑马鱼体内模型、转录组学和AOP网络，可以全面、基于通路地评估化学物质的毒性。

本研究利用网络毒理学探讨了4-MBC引起的发育神经毒性机制。通过斑马鱼暴露实验验证了4-MBC的发育神经毒性，并通过剂量依赖性转录组学从多个角度全面验证了毒性机制。本研究的目标如下：（1）识别与4-MBC引起的发育神经毒性相关的关键靶点；（2）通过斑马鱼暴露实验确认4-MBC的发育神经毒性；（3）通过整合网络毒理学和剂量依赖性转录组学探索4-MBC引起的发育神经毒性的核心机制。这项研究不仅提供了关于4-MBC引发发育神经毒性的分子机制的新见解，同时也证明了将网络毒理学与剂量依赖性转录组学结合在解析化学物质毒性机制方面的有效性。

章节摘录

4-MBC靶点的收集

为了构建一个全面的4-MBC靶点库，我们使用化合物的标准结构和SMILES表示法，在CTD（https://ctdbase.org/）和ChemMapper（https://www.lilab-ecust.cn/chemmapper/）数据库中搜索潜在的4-MBC靶点，这些数据库以人类为研究对象。具体的搜索参数包括“4-MBC”、“4-Methylbenzylidene Camphor”以及SMILES表示“CC1=CC=C(C=C1)/C=C/2\\C3CCC(C2=O)(C3(C)C)C”。此外，我们还使用了中位数作为筛选标准

识别与4-MBC引起的发育神经毒性相关的潜在靶点及其富集分析

通过将160个与4-MBC相关的靶点与10,106个与发育神经毒性相关的靶点进行交叉分析，共识别出150个介导4-MBC诱导发育神经毒性的潜在靶点（图1A）。利用STRING数据库构建了一个全面的PPI网络，并使用Cytoscape软件对节点拓扑属性进行了深入分析，从而生成了一个优化且直观的PPI网络可视化图像（图1B）：该图显示了...

讨论

4-MBC是一种新兴的有机环境污染物，对生态系统和人类健康具有潜在危害。尽管先前有研究报告指出4-MBC暴露会导致神经系统疾病，但其分子靶点和毒性级联反应仍不明确。本研究结合了网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟、行为测定、转录组学分析以及AOP框架，系统地探讨了4-MBC的神经毒性效应并阐明了其...

结论

总之，本研究结合了网络毒理学、剂量依赖性转录组学、AOP框架以及体内斑马鱼实验，研究4-MBC的发育神经毒性。表型测试显示4-MBC引发了胚胎发育畸形（如心包水肿和尾部畸形）并抑制了幼体的运动能力。共筛选出150个候选靶点和10个核心靶点，包括BDNF和GRIN2B，富集分析进一步确定了...

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文研究的任何竞争性财务利益或个人关系。

CRediT作者贡献声明

Junxing Hu：可视化、软件开发、正式分析。Suqi Tang：验证、研究、数据管理。Li Sun：验证、正式分析、数据管理。Shixia Xu：写作 - 审阅与编辑、监督、项目管理、概念构思。Huijie Zhang：验证、正式分析、数据管理。Jiao Chen：验证、正式分析、数据管理。Jing Wang：验证、正式分析、数据管理。Miao Guan：写作 - 审阅与编辑、监督、资源协调、项目管理

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2022YFF1301602）对S.X.的支持，以及国家自然科学基金（NSFC）的支持（项目编号32270453给予S.X.，项目编号42207324给予M.G.）。我们衷心感谢Mengqi Shuai和Xiaoyi Zhang在微量注射和数据分析方面的协助，以及Xinrui Zhao对斑马鱼设施的精心维护。

Xiaoyang Lu|Miao Guan|Suqi Tang|Junxing Hu|Li Sun|Jing Wang|Jiao Chen|Huijie Zhang|Shixia Xu

中国南京师范大学生命科学学院，长江中下游生物多样性保护与可持续利用重点实验室