重组双歧杆菌内切型β-N-乙酰葡糖胺酶实现从糖蛋白高效释放生物活性N-聚糖

《Enzyme and Microbial Technology》：Recombinant Bifidobacterial Endo -β-N -Acetylglucosaminidases Enable Efficient Release of Bioactive N -Glycans from Glycoproteins

　　

糖基化是最重要的普遍翻译后修饰之一，赋予蛋白质多样的结构，超过一半的真核蛋白质为糖基化形式。鉴于替代性去糖基化方法的局限性，鉴定和表征新型糖苷酶对于理解聚糖的多样作用具有重要意义。研究人员以核糖核酸酶B（RNase B）为模型糖蛋白，评估了来自鸡双歧杆菌鸡亚种（Bifidobacterium pullorum subsp. pullorum）的EndoBP、来自柏双歧杆菌（Bifidobacterium kashiwanohense）的EndoBK和来自波希米亚双歧杆菌（Bifidobacterium bohemicum）的EndoBbo这三种重组内切型β-N-乙酰葡糖胺酶（ENGase）的酶活性，并阐明了各酶的最适pH和温度条件。释放的N-聚糖通过苯酚-硫酸法定量，所得N-聚糖组成通过基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）分析。此外，生成了比较结构模型以为酶的保守GH18催化区提供结构背景。基于三种酶在糖蛋白混合物（乳清、牛IgG、牛乳铁蛋白和大豆蛋白）上的表观动力学分析，以总蛋白质量表示的Km值分别为3.44、7.18和2.85 mg/mL，Vmax值分别为2.29×10-2、2.52×10-2和1.35×10-2 mg/mL·min（对应EndoBP、EndoBK、EndoBbo）。乳清来源N-聚糖的MALDI-TOF/TOF-MS分析揭示了明显的酶依赖性模式，EndoBP、EndoBK和EndoBbo处理后分别检测到31、21和10种N-聚糖组成。EndoBP表现出最广泛的聚糖释放谱，而EndoBbo在考察条件下产生相对较窄的谱。这些发现突出了三种ENGase之间不同的聚糖释放行为，并支持从乳清中酶法回收结构多样、高附加值的N-聚糖组分作为一种潜在的乳清高值化策略。

研究背景方面，糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰之一，N-聚糖（N-glycan）通过天冬酰胺连接，参与细胞识别、蛋白质折叠稳定及病原防御等过程。传统化学法（如β-消除、肼解）易破坏聚糖结构，酶法常用肽-N-糖苷酶（PNGase）但受核心岩藻糖限制，已有内切糖苷酶（如EndoH、EndoF系列）底物谱窄。双歧杆菌因携带大量糖苷水解酶基因岛成为新型ENGase（endo-β-N-acetylglucosaminidase，内切型β-N-乙酰葡糖胺酶，GH18家族）的重要来源，此前仅EndoBI-1被深入表征。为拓展乳清等低值副产物中N-聚糖的酶法回收路径，研究人员对三种未表征的双歧杆菌重组ENGase（EndoBP、EndoBK、EndoBbo）进行功能与结构系统评价，论文发表于《Enzyme and Microbial Technology》。

关键技术方法上，研究人员以商业乳清粉与大豆蛋白制备蛋白分离物，联合牛血清IgG、牛乳铁蛋白（bLf）构成复合糖蛋白底物；以RNase B（单高点甘露糖位点）经95℃变性验证酶活；采用苯酚-硫酸法比色定量释放聚糖；用2-氨基苯甲酸（2-AA）标记后经棉纤HILIC脱盐，负离子反射模式MALDI-TOF/TOF-MS（1000–4000 m/z）鉴定组成；动力学用Lineweaver–Burk为主、Eadie–Hofstee与Hanes–Woolf为辅线性化求K_m、V_max、k_cat；结构端以Swiss-Model同源建模GH18域，DALI叠比对模板Endo-COM（PDB:6KPL）与AD2PF-ChiA（PDB:2DSK），PROCHECK/Ramachandran校验。

研究结果部分，3.1节通过在RNase B（17 kDa）上SDS-PAGE迁移位移至14–15 kDa，确认三种酶均具切割壳二糖核心的高甘露糖释放能力。3.2节用乳清/IgG/bLf混合底物过夜终点法绘3D响应面，三酶均在pH 5–6、30–37℃终点释放最高，EndoBK峰值在pH 5/37℃，EndoBP与EndoBbo在较低中温更高，但属终点非初速率热稳定数据。3.3节对复合底物（0.9–7.2 mg/mL总蛋白）测动力学，EndoBP、EndoBK、EndoBbo的K_m为3.44、7.18、2.85 mg/mL，V_max为2.29×10^-2、2.52×10^-2、1.35×10^-2 mg/mL·min，k_cat为0.916、1.008、0.540 min^-1，k_cat/K_m为0.266、0.140、0.189 mL·mg^-1·min^-1，EndoBP催化效率最优。3.4节乳清N-聚糖MALDI分析显示EndoBP、EndoBK、EndoBbo分别检出31、21、10种组成，含高甘露糖与复杂型，其中唾液酸化分别10、6、1种，岩藻糖化2、1、0种，仅EndoBP检出NeuGc（N-羟乙酰神经氨酸）含1种，EndoBP谱最宽。3.5节同源建模表明三酶GH18域与模板Z-score 38.5–45.5，保守Asp为催化碱、Glu为催化酸，叠合RMSD 0.7 ?，Ramachandran最适区≥87.3%，支持GH18架构保守。

讨论部分指出，三酶在壳二糖核心水解机制上与PNGase F不同——保留蛋白侧单GlcNAc且不改Asn为Asp，利于回收完整聚糖；RNase B变性实验仅为酶活验证非折叠蛋白普适活性证明。终点温度响应不等同热稳定。混合底物K_m反映复合体系非单一底物亲和。与EndoBI-1广谱、EndoH限高甘露糖、EndoS依赖IgG Fc构象相比，三双歧杆菌酶呈中间广谱性，EndoBP最接近EndoBI-1风格。乳清高值化场景下，EndoBP适广谱回收，EndoBbo适窄谱选择性释放。结构差异由活性裂隙表面环与亚位点塑造而非催化残基变化。局限为未做固定化、热稳定预孵育及构象配对实验，模型非晶体结构。

结论部分翻译：本研究从鸡双歧杆菌鸡亚种、柏双歧杆菌、波希米亚双歧杆菌分别获得重组EndoBP、EndoBK、EndoBbo，表征其去糖基化活性、最适条件（pH 5、37℃）、动力学及三维结构。三酶均从RNase B与牛乳清蛋白释放N-聚糖；Lineweaver–Burk、Eadie–Hofstee、Hanes–Woolf给出可比参数；MALDI-TOF/TOF-MS揭示差异化N-聚糖谱；比较建模与序列分析支持GH18整体折叠及Asp/Glu催化残基保守。综上，三酶能从糖蛋白释放多样生物活性N-聚糖，凸显将乳清这一丰富乳品副产物高值化为食品与生物技术用益生元N-聚糖可持续源头的潜力。