《European Journal of Protistology》：Detection of endocytobionts inhabiting the macronucleus of
Frontonia paramagna (Ciliophora, Peniculida)
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摘要*Frontonia* 属，一个分布广泛的纤毛虫属，其细菌内共生体研究尚不充分。在此，我们采用形态学与分子相结合的方法，调查了上海种群 *Frontonia paramagna* 的内共生微生物群。靶向 16S rRNA 基因的荧光原位杂交（FISH）结合 V3–V4 高
摘要
*Frontonia* 属，一个分布广泛的纤毛虫属，其细菌内共生体研究尚不充分。在此，我们采用形态学与分子相结合的方法，调查了上海种群 *Frontonia paramagna* 的内共生微生物群。靶向 16S rRNA 基因的荧光原位杂交（FISH）结合 V3–V4 高通量测序，一致鉴定出 *Caedimonas* 为细菌共生体，特定定位于宿主的大核内。FISH 和透射电子显微镜证实了这种高普遍性的大核内定殖，并揭示了共生体缺乏鞭毛和 R 体。全长 16S rRNA 基因序列的系统发育分析将 *F. paramagna* 共生体置于一个受支持良好的分支内，该分支包含来自不同宿主的 *Caedimonas*。对 16S rRNA 内部切除元件（IEE）的比较分析显示，与 *Frontonia* 相关的谱系与其他来自不同纤毛虫的 *Caedimonas* 菌株之间存在显著的序列和二级结构分歧。我们保守地将该谱系命名为 *Caedimonas varicaedens* Fpa。这些独特的分子特征表明，*Caedimonas* 的多样性和宿主分布远未被充分描述，基因组学方法将是评估属内物种界限以及 R 体遗传决定因子的可能存在、分布和水平转移所必需的。
引言
纤毛虫由于具有吞噬活性高和核二元性等特征，为多样的共生体提供了有利的栖息地 (Fokin, 2004; Fokin and Serra, 2022; Song et al., 2024)。分子调查揭示了纤毛虫内丰富的细菌共生体多样性，主要来自 α 变形菌纲，以及 β 变形菌纲、γ 变形菌纲、厚壁菌门和疣微菌门，其中少膜纲和动基片纲的纤毛虫 emerges as 特别有价值的模型用于研究这些共生系统 (Dagar et al., 2024)。这些内共生关系可以是专性或非专性的，在生态和进化上至关重要，在该形态和遗传多样性群体 的分化和表型创新中发挥了重要作用 (Dagar et al., 2024; Husnik et al., 2021; Monteil et al., 2019)。在某些情况下，共生是互惠互利的：共生体增强宿主的代谢、营养和防御，而纤毛虫则提供受保护的生态位和资源作为回报 (Flemming et al., 2022; He et al., 2019; Mironov and Sabaneyeva, 2020)。
此类互惠互利的一个研究透彻的例子是 *Paramecium*（少膜纲）中的"kappa 颗粒”，它赋予宿主“杀手”特征，并提供强大的种内竞争优势 (Jurand et al., 1978; Preer et al., 1974; Schrallhammer and Schweikert, 2009; Sonneborn, 1938)。值得注意的是，这种生态趋同表型发生在系统发育上不同的细菌谱系中。分子系统发育分析已将以前归类为 *Caedibacter* 的经典 kappa 样、产生 R 体的共生体置于 γ 变形菌纲或 α 变形菌纲中 (Beier et al., 2002; Schrallhammer et al., 2018)。杀手特征与质粒、噬菌体或转座子连锁决定因子的反复关联进一步表明，移动遗传元件在介导 R 体的共生表型进化中发挥了重要作用 (Jeblick and Kusch, 2005; Quackenbush and Burbach, 1983; Quackenbush et al., 1986; Pirritano et al., 2020; Pond et al., 1989; Raymann et al., 2013)。以前归类为 *Caedibacter* 的 α 变形菌代表现在被置于 *Caedimonas* 属中，目前仅包含一个描述物种 *Caedimonas varicaedens* (Schrallhammer et al., 2018)。
*C. varicaedens* 的已知宿主主要来自 *Paramecium* 属 (Flemming et al., 2022; Fokin and G?rtz, 1993; Kusch et al., 2000; Schmidt et al., 1987)，这可能归因于宿主的快速生长、广泛分布和易于实验室培养。引人注目的是，没有关于 *Frontonia* 中存在 *Caedimonas* 的报道，*Frontonia* 是一个非单系属，与 *Paramecium* 在同一系统发育目内密切相关 (Serra et al., 2021; Wang et al., 2025)。鉴于这种系统发育上的邻近性，此类报道的缺失值得注意，可能反映两个因素：*Frontonia* 的食藻饮食可能限制细菌摄入，以及更重要的是，对该群体胞内共生症研究的显著缺乏 (Fokin and Schweikert, 2003)。因此，在本论文中，我们首次描述了一个 *Caedimonas* 谱系与淡水纤毛虫 *Frontonia paramagna* 之间的稳定关联。在此基础上，我们进一步将该谱系的 16S rRNA 内部切除元件（IEE）与来自不同宿主（例如 *Paramecium* 和 *Peridinium cinctum*）的 *Caedimonas* 进行比较，并讨论其分类地位以及与 *F. paramagna* 的共生关系。
章节片段
宿主采集与培养
*Frontonia paramagna* 于 2019 年 10 月采集自中国上海华东师范大学闵行校区的一个永久性淡水池塘（31°01′41″N, 121°27′08″E）。原始培养物在 25 °C 下建立，使用农夫山泉矿泉水作为培养基，并提供莱茵衣藻和麦粒发酵细菌作为食物来源。专门针对该种群共生细菌的研究始于 2023 年。
光学显微镜与透射电子显微镜
活体 *F. paramagna* 细胞
宿主核与内共生体的形态特征
*F. paramagna* 的单个大核呈球形或椭球体，直径约 75 μm (n = 10)，位于细胞的中后部区域（图 1A, B）。它伴有大约 17 个小核 (n = 5)，每个直径约 4 μm，分布在靠近大核或细胞质其他位置，无固定位置（图 1B）。使用探针 EUB338 和 cc23a 进行的荧光原位杂交产生了阳性信号，用于
*Frontonia paramagna* 内共生体的鉴定及分类学意义
*Caedimonas* 属的成员长期以来主要在模式纤毛虫属 *Paramecium* 中被报道，仅在 *Euplotes* 和 *Peridinium* 中有零星记录 (Boscaro et al., 2019; Flemming et al., 2022; Fokin and G?rtz, 1993; Schrallhammer et al., 2006, Schrallhammer et al., 2018; Schweikert and Meyer, 2001; Springer et al., 1993)。在本研究中，我们首次鉴定出存在于非模式纤毛虫 *F. paramagna* 大核内的 *Caedimonas*，并且我们
CRediT 作者贡献声明
刘明义: 写作 - 初稿，调查，数据整理。张钱钱: 写作 - 审阅与编辑，监督，资金获取。于雷: 形式分析。叶灵芝: 数据整理。郭军琦: 形式分析。Giulio Petroni: 写作 - 审阅与编辑。靳明飞: 资金获取。范新鹏: 写作 - 审阅与编辑，监督，资金获取。
未引用参考文献
Ciufo et al., 2018
Heruth et al., 1994
Linka et al., 2003
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些因素可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了 国家自然科学基金 (42176163, 32570525) 和 华东师范大学青年教师科研能力提升项目 的支持。
刘明义 | 张钱钱 | 于雷 | 叶灵芝 | 郭军琦 | Giulio Petroni | 靳明飞 | 范新鹏
