可激活的比率荧光共轭聚合物，用于不可逆结合和调节淀粉样β蛋白的致病性

《European Polymer Journal》：Activatable ratiometric fluorescent conjugated polymers for irreversible binding and pathogenicity regulation of amyloid β protein

　　

摘要

内在无序蛋白（IDPs）的错误折叠和聚集与许多神经退行性疾病有关。作为代表性的IDP，β-淀粉样蛋白（Aβ）在阿尔茨海默病（AD）中起着关键作用。在这项研究中，我们设计并合成了一种反应激活的比率荧光共聚物（PFP-NA-NO₂）作为Aβ结合剂，它可以在促进Aβ清除的同时调节其致病性。这种功能化的共聚物具有刚性的π-共轭主链和带有活性基团的柔性侧链，这赋予了它显著的构象可塑性，同时满足了荧光共振能量转移（FRET）的结构要求。平面主链可以竞争性地占据Aβ的疏水核心，而柔性侧链则可以适应Aβ的构象变化，并与可访问的氨基发生共价反应。这种协同作用增强了I_{530 nm}/I_{417 nm}的比率，使PFP-NA-NO₂成为一种能够定量检测Aβ的比率荧光探针。分子对接结果进一步表明，PFP-NA-NO₂与Aβ物种之间存在多种结合模式，结合能低至-10.07 kcal/mol。重要的是，PFP-NA-NO₂与Aβ的结合有效调节了Aβ聚集的致病性，显著降低了Aβ引起的神经毒性。此外，PFP-NA-NO₂恢复了小胶质细胞对Aβ的吞噬作用。由此产生的非毒性PFP-NA-Aβ聚集物更容易被小胶质细胞内化，从而促进了Aβ的清除。这些发现表明比率荧光共聚物在Aβ检测和致病性调节方面的潜力，为研究和调节神经退行性疾病及其他与IDP相关的疾病提供了一个有前景的分子平台。

引言

内在无序蛋白（IDPs）是一类在生理条件下缺乏稳定三维结构但同时执行基本生物功能的蛋白质。IDPs在真核生物中广泛存在，在人类蛋白质组中尤为普遍。IDPs的固有构象动态和结构可塑性使它们在许多基本细胞过程中发挥关键作用。然而，这种内在的结构灵活性也使它们容易发生错误折叠和异常聚集，从而导致正常功能的丧失或细胞毒性作用，从而成为多种疾病的根本病理机制[1]、[2]、[3]。值得注意的是，阿尔茨海默病（AD）中的β-淀粉样蛋白（Aβ）和帕金森病（PD）中的α-突触核蛋白（α-Syn）是涉及IDPs的典型致病性聚集实例。尽管这些神经退行性疾病的精确机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明，IDPs的可溶性寡聚体中间体在纤维沉积之前就表现出显著的神经毒性[4]。这些有毒物种会破坏膜完整性，诱导氧化应激，干扰细胞内信号通路，并最终导致神经元死亡[5]。此外，这种病理聚集物还具有促进同源蛋白质错误折叠和沉积的能力，形成自我传播的反馈循环，加剧蛋白质稳态功能障碍并损害细胞清除机制，从而加速疾病进展[6]。鉴于IDPs在神经退行性疾病中的核心作用，对其进行敏感检测和有效调节的策略对于机制研究和治疗开发至关重要。

因此，针对易于聚集的IDPs开发能够特异性识别这些蛋白质、调节其聚集或促进其清除的靶向结合剂对于阐明致病机制、实现早期检测和开发与蛋白质聚集相关的疾病治疗方法具有重要意义。随着研究的进展，已经报道了多种类型的IDP结合剂，包括传统肽[7]、[8]、[9]、抗体[10]、[11]、[12]、[13]，以及新兴的纳米颗粒[14]、[15]、[16]、[17]，这些结合剂在检测、聚集调节和神经保护方面显示出潜力。荧光探针作为高度敏感和选择性的分子工具非常有用。其中，硫黄素T（ThT）被广泛认为是用于淀粉样蛋白染色的“黄金标准”荧光染料，在IDPs的检测和成像中显示出显著的价值[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。然而，小分子荧光探针存在固有的局限性，如光漂白和潜在的细胞毒性。此外，由于IDPs的构象不稳定性，它们与探针的结合亲和力相对较弱，导致相互作用虽然高度特异性但容易 reversibility[3]。因此，实现IDP致病性的稳定调节和逆转仍然是一个主要挑战，这激发了开发具有增强结合和调节能力的新探针平台的动力。

共聚物（CPs）由于其独特的光学特性和化学可调结构，已成为生物医学应用中荧光探针的有希望的候选者[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。值得注意的是，CPs表现出与IDPs相似的聚集倾向，这使得它们能够以不同于小分子结合剂的方式与IDPs相互作用[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]。这里使用由42个氨基酸组成的Aβ作为模型IDP，其序列为DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA。Aβ可以错误折叠并聚集形成有毒的寡聚体和纤维。这些聚集物会损害细胞膜，诱发氧化应激，干扰钙平衡，并损害突触功能，最终导致神经元死亡，从而促进神经退行性疾病的进展[38]。通过合理的结构设计（如图1所示），我们设计并合成了一种可激活的比率荧光共聚物PFP-NA-NO₂，它可以通过与Aβ的共价相互作用被激活，从而实现敏感和选择性的Aβ检测。聚（芴苯）（PFP）主链和改性的萘酰亚胺衍生物（NA）分别作为供体和受体，建立了基于荧光共振能量转移（FRET）的比率检测机制。NA的羟基与对硝基苯氯甲酸盐反应生成活化的碳酸酯基团。这些活化的碳酸酯基团可以与Aβ上的氨基发生共价结合。当激发PFP-NA-NO₂时，PFP主链和NA之间的FRET被硝基通过光诱导的电子转移（PET）抑制。然而，在Aβ存在的情况下，活化的碳酸酯基团与Aβ的氨基反应，导致对硝基苯基的脱离和NA荧光的恢复。这种恢复导致NA与PFP的荧光强度比显著增加，成为Aβ检测的敏感指标。作为一种比率探针，PFP-NA-NO₂的荧光比率不受外部因素的影响，即使在复杂的生物环境中也能保证高适应性和精度。此外，PFP-NA-NO₂与Aβ共价结合形成PFP-NA-Aβ复合物。由于共聚物主链的强疏水性，它促进了新的PFP-NA-Aβ聚集物的形成。重要的是，这些PFP-NA-Aβ聚集物不表现出神经毒性效应，有效恢复了PC-12细胞的活力并增强了小胶质细胞清除Aβ的能力。因此，这种可激活的比率荧光探针PFP-NA-NO₂可以特异性检测Aβ，调节其聚集途径，并保护神经细胞，为Aβ相关疾病提供有希望的检测和致病性调节平台。

章节摘录

PFP-NA-NO₂的合理设计、合成和光物理特性

对于基于FRET机制的比率荧光共聚物的设计，选择合适的供体和受体至关重要。选择PFP主链和NA作为供体和受体，因为它们具有高效的FRET相互作用[39]。通过对荧光团NA进行功能化，形成了活化的碳酸酯基团，并将硝基配制成淬灭剂以建立PET机制。PFP主链和NA通过寡乙烯连接

结论

总结来说，本研究报道了一种反应性比率荧光共聚物（PFP-NA-NO₂的合理设计和合成，它通过与Aβ的疏水驱动的共价相互作用形成稳定的键。PFP-NA-NO₂的构象灵活性使其能够与Aβ物种进行多点协同结合，从而实现探针的激活和I_{530 nm}/I_{417 nm}比率的显著增加。结合后，PFP-NA-NO₂参与并调节Aβ的聚集，有助于

实验部分

实验部分、合成和表征以及支持性数据见补充材料。

CRediT作者贡献声明

Ziqi Zhang：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，项目管理，方法学，研究，资金获取，数据分析，概念化。Yun Yao：研究，数据分析，数据管理。Leyi Fan：研究，数据分析。Yan Qi：撰写——审阅与编辑，资金获取，概念化。Zhenhao Zhang：撰写——审阅与编辑，概念化。Xingchun Gou：撰写——审阅与编辑，资源准备，

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号：22507103）、陕西省自然科学基础研究计划（项目编号：2024JC-YBQN-0085）、西安医学院博士研究生启动基金（项目编号：2023BS09）、陕西省教育厅资助的科学研究计划（项目编号：25JR152）、西安市自然科学基金（项目编号：26ZRKX00005）和科学技术创新基地-开放平台的财政支持。

Ziqi Zhang于2021年在陕西师范大学化学与化学工程学院获得分析化学博士学位。她目前是西安医学院基础与转化医学研究所的讲师。她的当前研究兴趣包括多功能共聚物的设计和合成、生物传感和成像分析，以及神经退行性疾病的早期诊断和干预。

Ziqi Zhang|Yun Yao|Leyi Fan|Yan Qi|Zhenhao Zhang|Xingchun Gou|Qiong Yuan|Yanli Tang

陕西脑疾病重点实验室及西安医学院基础与转化医学研究所，西安710021，中国