《Fish & Shellfish Immunology》：Synergism of duplicated Gasdermin Eb in
Carassius auratus gibelio unveiling a regulatory amplification loop for pyroptosis
编辑推荐：
•*Carassius auratus* gibelio 的多倍体化产生了四个 GSDME 旁系同源基因（*Ca*GSDMEa1/a2/b1/b2）。•*Ca*GSDMEb2 在检测到胞质脂多糖（LPS）后保留了祖先的焦亡活性。•*Ca*GSDMEb1 无法执行焦亡，因为它能
• *Carassius auratus* gibelio 的多倍体化产生了四个 GSDME 旁系同源基因（*Ca*GSDMEa1/a2/b1/b2）。
• *Ca*GSDMEb2 在检测到胞质脂多糖（LPS）后保留了祖先的焦亡活性。
• *Ca*GSDMEb1 无法执行焦亡，因为它能抵抗半胱天冬酶（caspase）的蛋白水解激活。
• *Ca*GSDMEb1 通过与 *Ca*caspase-19 结合，放大了 *Ca*GSDMEb2 介导的焦亡。
引言 焦亡是一种程序性细胞死亡形式，对抗菌免疫至关重要 [[1], [2], [3]]。Gasdermin (GSDM) 家族作为焦亡的执行者，关键调控炎症、感染免疫和癌症进展 [4,5]。在羊膜动物中已鉴定出六个 GSDM 成员，包括 GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME 和 pejvakin (PJVK)。然而，据报道硬骨鱼中仅有 GSDME 和 PJVK，无脊椎动物中仅有 GSDME 的一个成员 [6,7]。进化分析表明，GSDME 代表脊椎动物 GSDM 家族的祖先成员 [8]。有趣的是，硬骨鱼中的 GSDME 分化为两种亚型（GSDMEa 和 GSDMEb），突显了鱼类作为研究 GSDM 进化的关键模型 [[8], [9], [10]]。
在硬骨鱼中，不同物种已鉴定出功能各异的 GSDME 亚型，其功能分歧已有充分记录。例如，大菱鲆 GSDMEa 介导抗弧菌防御，而斑马鱼 GSDMEb 执行非经典焦亡，分别反映了哺乳动物 GSDMD 和 GSDME 在抗菌免疫和炎症性细胞死亡中的分工 [9,11]。关于蛋白水解调控，哺乳动物 GSDMD 被炎症半胱天冬酶（caspase-1/4/5/11）切割，GSDME 被 caspase-3 切割，GSDMB 被多种半胱天冬酶（caspase-1/3/6/7）切割，GSDMC 被 caspase-8 切割 [[12], [13], [14]]。相比之下，硬骨鱼仅通过 GSDME 旁系同源基因实现功能分区：GSDMEa 被凋亡半胱天冬酶（caspase-3/7）加工，类似于哺乳动物 GSDME，而 GSDMEb 被炎症半胱天冬酶（caspase-1/19b）切割，与哺乳动物 GSDMD 趋同 [8]。此外，一些硬骨鱼 GSDME 表现出双向调控，例如大菱鲆 GSDMEa 被 SmCASP3/7 激活并被 SmCASP6 灭活，以及剑尾鱼 GSDMEc 的抑制性切割，平行于哺乳动物 GSDMB 被凋亡半胱天冬酶（caspase-3/6/7）介导的灭活 [11,15,16]。因此，通过单一祖先基因的重复和切割特异性分歧，硬骨鱼 GSDME 再现了多种哺乳动物 GSDM 的功能复杂性，并为理解脊椎动物免疫进化中的基因重复和亚功能化提供了一个范式。
多倍体化是物种形成的主要驱动力 [[17], [18], [19]]。硬骨鱼特有的第三轮全基因组重复（3R-WGD）促进了它们的多样化 [20]。天然六倍体 *Carassius auratus gibelio*（草金鲫）是研究基因重复后功能进化的优秀模型 [21,22]。基于我们之前在其 TLR 家族方面的工作 [23]，我们旨在探索多倍体 *crucian carp*（鲫鱼）中 GSDME 旁系同源基因潜在的亚功能化。这种具有重要经济价值的物种易受气单胞菌属（*Aeromonas hydrophila*）等细菌病原体感染 [[24], [25], [26]]。鉴于斑马鱼 Caspase-19/GSDMEb 通过 LPS 感知在抗菌防御中的作用 [27]，表征草金鲫中的 GSDME 可能揭示新的治疗靶点。
在此，我们在 *C. auratus gibelio* 中鉴定了两个 GSDMEb 旁系同源基因（*Ca*GSDMEb1/b2）。我们发现 *Ca*caspase-19 切割 *Ca*GSDMEb2，但不切割 *Ca*GSDMEb1，通过 *Ca*caspase-19 介导的胞质 LPS 感知轴触发焦亡。虽然核心 LPS 感知机制在硬骨鱼中是保守的，但我们的直接证据揭示了一个以前未被认识的调控层，即一种耐切割的旁系同源基因（*Ca*GSDMEb1）发挥放大该信号级联的作用。尽管 *Ca*GSDMEb1 缺乏功能性半胱天冬酶切割基序，全长 *Ca*GSDMEb1 增强了 *Ca*caspase-19 介导的 *Ca*GSDMEb2 切割。这些结果表明重复的 GSDMEb 亚型发生了亚功能化，为理解脊椎动物 GSDM 家族的功能多样化提供了机制见解。
章节摘要 实验动物和细胞 平均体重为 100 ± 4.31 g 的实验用 *C. auratus gibelio* 购自中国湖北省武汉的一家商业水产养殖设施。实验前，鱼在含有脱氯自来水（温度：23-25°C；溶解氧 >6 mg/L；pH 7.2-7.6）的循环水养殖系统中适应 14 天，处于自然光照周期条件下。每个实验组（n = 20 条鱼/组）饲养在一个水族箱中（尺寸：80 cm
CaGSDMEb1/2 的 N 端对细菌产生生长抑制作用并参与焦亡 *Ca*GSDMEb1 (GenBank:
XM_026229038.1 ) 和 *Ca*GSDMEb2 (GenBank:
XM_026284309.1 ) 的全长 cDNA 分别为 1674 bp 和 2258 bp，分别编码 471 和 472 个氨基酸，位于第 41 号和第 16 号染色体上（表 1）。系统发育分析显示，脊椎动物 GSDME 同源物形成一个独特的支系，硬骨鱼 GSDME 进一步细分为 GSDMEa 和 GSDMEb 亚组。在 GSDMEb 亚组中，*Ca*GSDMEb1/b2 与其他鲤科鱼类的直系同源物关系最密切，包括
讨论 1′ GSDM 家族执行焦亡并介导炎症和抗菌反应 [5]。在硬骨鱼中，GSDME 分化为 GSDMEa 和 GSDMEb，它们通过不同的半胱天冬酶切割基序表现出功能特化 [9]。在 *Carassius auratus gibelio*（*C. auratus gibelio*）中，我们鉴定了两个 GSDMEb 旁系同源基因：*Ca*GSDMEb1 和 *Ca*GSDMEb2。重要的是要注意，胞质 LPS-caspase-19 轴的发现最初是在斑马鱼中建立的 [27]。我们的研究并非旨在
结论 总之，这项研究表明 *Carassius auratus gibelio* 中重复的 GSDME 旁系同源基因之间存在显著的功能分歧，提供了基因重复后进化创新的一个例子。虽然 CaGSDMEb2 似乎保留了祖先的、经典的角色，即通过接受 caspase-19 介导的蛋白水解激活作为焦亡的执行者，*Ca*GSDMEb1 可能进化出了一种独特的调控功能。它对切割的抵抗，是由于半胱天冬酶识别位点的关键突变
伦理声明 所有实验均按照中国科技部《实验动物管理和使用指南》进行。实验程序获得了华中农业大学实验动物伦理委员会的批准（批准号 HZAUFI-2023-016）。尽一切努力将动物的痛苦降至最低。
作者贡献 Y.H.F. 概念化；软件；形式分析；验证；调查；可视化；方法论；写作—初稿。M.M.W. 形式分析；写作—审查与编辑。C.J.D. 软件和资源。Y.T.Z. 数据整理和可视化；J.F.Y. 资源；写作—审查与编辑。L.J.L. 概念化；写作—初稿；写作—审查与编辑。
资金 这项工作得到了国家自然科学基金 32073013的支持。
范义辉 |吴苗苗 |戴彩娇 |朱玉婷 |袁军发 |李丽娟
