染色体编辑 利用大肠杆菌高效生产邻氨基苯甲酸

《Food Bioscience》：Chromosome editing Escherichia coli for efficient production of colanic acid

　　摘要：大分子科兰酸因其独特的物理化学和生物活性特性，在生物医学、食品和化妆品行业展现出广阔的应用潜力。本研究通过染色体编辑技术开发了一种高效的科兰酸生产大肠杆菌。全面评估了中心碳代谢、σ因子调控以及多种细胞膜成分（包括O-抗原、聚-β-1,6-N-葡萄糖胺、唾液酸、纤维素、第4型荚膜、卷曲蛋白和鞭毛）的生物合成对科兰酸生成的影响。基于这些分析，通过删除ptsG基因、rpoS基因以及三个基因簇（rfbBDACXglfwbbHIJKL、nanRATEKQ和flhEABcheZYBRtaprcheWAmotBARflhCD），构建了WZM29菌株，显著提高了科兰酸的产量。随后，利用不同强度的核糖体结合位点系统优化了galU、galE、ugd、galP和glk基因的表达。将最优表达盒整合到WZM29的染色体中，获得了无质粒生产的WZM32菌株。在5升生物反应器中，WZM32菌株的科兰酸产量达到了22.27克/升，葡萄糖利用率可达0.34克/克。本研究中采用的染色体编辑技术使大肠杆菌能够在不添加任何诱导剂或抗生素的情况下稳定发酵并大规模生产科兰酸，从而降低了生产成本。

引言：科兰酸是一种由大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和肠杆菌合成的胞外多糖，可作为抵御环境压力的保护性大分子（Kasimova等，2023；Liu等，2019；Pando等，2017；Stevenson等，1996）。1963年，Goebel从大肠杆菌K235菌株中分离出这种高分子量的胞外多糖，并将其命名为科兰酸（Goebel，1963）。通过酸水解和薄层色谱法确定了其结构，发现它由含有岩藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖的重复六糖单元组成，摩尔比为2:2:1:1（Grant等，1969）。科兰酸由于其多孔结构和丰富的亲水表面基团，具有与透明质酸相当的保湿效果，使其成为先进化妆品领域的有前景的仿生替代品（Liu等，2019；Wu等，2024）。科兰酸富含L-岩藻糖，具有潜在的抗癌、抗肿瘤和抗炎生物活性（Lee等，2013）。研究表明，喂食科兰酸可延长秀丽隐杆线虫的寿命40%（Han等，2017）。这些发现突显了科兰酸在生物医学、化妆品及其他高附加值应用中的巨大潜力。先前的研究表明，通过碳流代谢工程、细胞膜结构的合理重塑和Rcs信号传导系统的调控，可以有效提高科兰酸的产量。目前报道的主要工程策略见表1。大肠杆菌的外膜结构复杂，包含Kdo2-脂质A、核心多糖、O-抗原（OA）、肠杆菌共抗原、科兰酸、聚-β-1,6-N-葡萄糖胺、唾液酸、纤维素、第4型荚膜（G4C）、卷曲蛋白、鞭毛和菌毛（Agladze等，2005；Lugtenberg等，1983；Wang等，2018；Wang等，2014）。越来越多的证据表明，简化细胞膜结构可以重新分配细胞资源，提高生物生产效率。去除非必需的表面结构（如鞭毛、肠杆菌共抗原和菌毛）可以减轻代谢负担，使碳流重新定向到生物质积累和目标化合物的生物合成（Niu等，2025；Qiao等，2021；Qiao等，2021）。值得注意的是，细胞表面重塑还能促进应激响应性胞外多糖科兰酸的产生。在大肠杆菌K12 W3110中定点删除waaF基因，在大肠杆菌K12 MG1655中删除waaU-Q基因簇，显著提高了科兰酸的合成效率（Ren等，2016；Wang等，2020）。进一步删除OA基因簇（Zhan等，2022）、磷脂基因簇或周质葡聚糖基因簇也能增加科兰酸的产量（Wu等，2024；Wu等，2023；Zhan等，2022）。总体而言，这些研究表明简化大肠杆菌的非必需外膜结构有助于促进科兰酸的生物合成。科兰酸生物合成的主要前体包括磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、十一碳烯基磷酸（Und-P）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）和UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）（Reid等，2021；Wang等，2020）。以往的研究主要集中在增强前体GDP-Fuc、UDP-Glc或UDP-GlcA的产量上。编码GDP-Fuc生物合成和科兰酸组装所需基因的科兰酸操纵子受Rcs信号传导系统的正向调控（Trisler等，1984）。作为科兰酸操纵子的关键正向调节因子，Rcs信号传导系统通过遗传改造得到广泛研究，包括删除Lon蛋白酶（RcsA降解剂）、H-NS（RcsA负调控因子）以及过表达rcsA和rcsD1–466（Qiao等，2021；Sadler等，2023；Wu等，2023）。此外，UDP-Glc由GalU从葡萄糖-1-磷酸（Glc-1P）合成，UDP-GlcA和UDP-Gal分别由Ugd和GalE合成（Cuthbertson等，2009；Stevenson等，1996）。过表达galU基因使UDP-Glc水平提高，科兰酸产量增加了4.24倍（Qiao等，2021）。然而，对前体基因galU、ugd和galE的协同工程对科兰酸生物合成的影响尚未进行系统评估。在大肠杆菌中，葡萄糖通过三种系统运输：磷酸转移酶系统（PTS）、半乳糖渗透酶（GalP）和ATP结合转运蛋白MglABC（Carreón-Rodríguez等，2023；Luo等，2014）。PTS是大肠杆菌中葡萄糖的主要吸收途径，在运输过程中消耗约50%的PEP（Yang等，2017）。因此，破坏PTS常被作为一种代谢工程策略，以保留PEP用于高附加值产品的生物合成。删除ptsG基因使运输系统失活，将大量PEP重新分配到唾液酸合成途径（Yang等，2017），并提高了苏氨酸的产量（Zhu等，2019）。过表达galP和glk基因可以补偿PTS删除导致的葡萄糖吸收和转化效率降低（Lu等，2012；Ma等，2025）。转录因子和σ因子是细菌调控网络的核心成分，协调代谢适应和应激反应。调控全局碳代谢因子可以显著改变碳流分布，提高代谢产物的产量。例如，在大肠杆菌中删除iclR基因会抑制丙酮酸途径并减少乙酸盐的积累（Daniel等，2011）。通过敲除碳中心调控基因arcA和cra，开发出了能够高效合成琥珀酸和1,3-丙二醇的底盘菌株（Egoburo等，2018）。此外，σ因子通过选择性启动子识别介导对环境和生理信号的转录响应。在大肠杆菌中已鉴定出七种σ因子：RpoE、RpoD、RpoH、RpoS、FliA、RpoN和FecI（Cook等，2013）。RpoS是一个重要的应激响应σ因子，协调与细菌适应、代谢和耐受性相关的基因表达（Ionescu等，2009）。RpoS的缺失激活了Rcs调控途径，增强了科兰酸合成基因簇的转录（Ionescu等，2009）。作为氮饥饿反应的主要调节因子，RpoN调控与氮吸收和同化相关的基因表达，使细菌能够适应氮含量的波动（Kadoya等，2015）。FecI调节与铁转运系统相关的基因表达，FliA控制鞭毛生物合成和运动相关基因的转录激活（Braun等，2005；Fitzgerald等，2014）。然而，其他σ因子在调节科兰酸生物合成中的潜在作用尚未得到充分研究。本研究选择了先前构建的底盘菌株WWM16作为进一步改良以增强科兰酸产量的起始菌株。首先评估了破坏PTS和全局碳调节因子对科兰酸生物合成的影响，构建了WZM01菌株，其科兰酸产量显著提高。在此基础上，进一步删除了多个σ因子基因，以研究它们在科兰酸合成中的调控作用。同时，分别或组合删除了负责非必需外膜结构生物合成的基因簇，以评估它们对科兰酸产量的贡献。UDP-Glc是合成UDP-GlcA和UDP-Gal的关键分支前体，因此高效分配碳流向核苷酸-糖生物合成对于科兰酸生产至关重要。因此，使用不同强度的RBS合理平衡了galU、galE和ugd基因的表达，同时过表达了galP和glk基因以增强葡萄糖的吸收和利用。通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将这些工程模块整合到WZM29的染色体中，获得了无质粒生产的WZM32菌株。经过反复优化发酵培养基后，在5升生物反应器中进行批次培养，最终科兰酸产量达到22.27克/升，比WWM16的产量提高了10倍。

细菌生长条件：大肠杆菌及其突变菌株的染色体编辑、质粒转化和增殖在含有10克/升蛋白胨、5克/升酵母提取物和10.0克/升NaCl的Luria Bertani（LB）培养基中进行，根据需要添加50毫克/升卡那霉素、10毫摩尔/升L-阿拉伯糖或50毫克/升壮观霉素以促进质粒复制。初始发酵使用标准培养基：20克/升葡萄糖、17.1克/升Na2HPO4·12H2O、3克/升NH4Cl、4克/升KH2PO4、0.5克/升...

讨论：先前的研究表明，通过多种工程策略可以提高科兰酸的产量，包括修饰脂多糖（LPS）结构、激活Rcs调控系统、优化核苷酸-糖前体供应和工艺工程（表1）。早期研究主要集中在细胞膜重塑上。例如，删除waaF基因或通过删除waa(L–Q)基因簇截短LPS核心，可改善科兰酸的积累...

结论：本研究通过多层染色体编辑技术构建了一种无质粒的高性能科兰酸生产菌株WZM32，系统性地优化了中心碳代谢、σ因子调控、细胞膜简化及前体供应（图9）。所开发的工程框架补充了以往提高科兰酸产量的策略。尽管本研究系统评估了多种遗传修饰对科兰酸产量的贡献，但...

致谢：本研究由江苏省基础研究计划资助，并得到江苏省合成生物学基础研究中心的支持（项目编号BK20233003）。