富含柑橘酮的鼠李糖乳杆菌胞外囊泡可减缓多柔比星诱导的间充质干细胞衰老，并通过多模块蛋白质货物的重塑作用维持其成骨和成软骨分化能力

《Food Bioscience》：Mangiferin-Loaded Lactobacillus rhamnosus Extracellular Vesicles Attenuate Doxorubicin-Induced Mesenchymal Stem Cell Senescence and Preserve Osteogenic and Chondrogenic Differentiation via Multi-Module Protein Cargo Remodeling

　　摘要
化疗诱导的间充质干细胞（MSC）衰老会损害组织修复能力，并限制再生疗法的效果。源自益生菌的细胞外囊泡（EVs）作为一种生物相容的纳米载体已受到关注，但其治疗效力的分子决定因素仍不明确。通过将鼠李糖乳杆菌PB LR76与芒果苷（MGF）共同培养，MGF被加载到细胞外囊泡中（浓度为2.66% w/w），并重塑了其蛋白质组，生成了多模块的抗衰老成分。PB LR76 MGF EVs（蛋白质浓度50 μg/mL，MGF浓度1.33 μg/mL）显著减轻了多柔比星诱导的MSC衰老：它们降低了活性氧（ROS）、DNA损伤（γ-H2AX）、与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性以及p53/p21的激活，同时保持了线粒体膜电位。在八组三菌株对比实验中（PB LR76、益生菌LGG、非益生菌ATCC 4356），仅有益生菌菌株的EVs保持了成骨和成软骨的分化能力（Alizarin Red S/Alcian Blue；Runx2、ALP、COL1A1、OSX、ACAN、COL2A1、SOX9），这证实了菌株的特异性。DIA Hyper定量蛋白质组学分析（549种蛋白质，n=3）识别出134种在PB LR76 MGF EVs中富集的差异蛋白，这些蛋白分布于四个功能模块中：氧化还原/应激蛋白（硫氧还蛋白，NADH脱氢酶，FC=30.8）、六种糖酵解旁系酶、DnaK GrpE/GroEL分子伴侣以及代谢/核糖体旁系蛋白。PubMed交叉参考将26种益生菌EV效应蛋白中的21种映射到10个人类信号通路，包括TLR2/NF-κB通路、整合素/FAK通路和NAD+/sirtuin依赖的p53去乙酰化通路。这些发现为益生菌EV的生物活性建立了蛋白质组到表型框架，并将PB LR76 MGF EVs定位为一种针对化疗引起组织损伤的食品级纳米治疗策略。

引言
间充质干细胞（MSC）是多能基质细胞，可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，在组织稳态、骨骼重塑和软骨维持中起着不可或缺的作用（Bianco等人，2008年；Pittenger等人，1999年）。化疗药物如多柔比星（DOX）通过DNA双链断裂、线粒体功能障碍和慢性氧化应激诱导MSC过早衰老，从而损害患者的内源性再生能力（Demaria等人，2017年；Kozhukharova等人，2018年）。衰老的MSC表现出不可逆的生长停滞、增高的β-半乳糖苷酶活性、持续的γ-H2AX焦点、p53/p21通路的上调以及分化能力受损（Mu?oz-Espín和Serrano，2014年）。目前尚无临床批准的干预措施能够针对化疗引起的MSC衰老，这成为癌症幸存者面临骨骼并发症（如骨质疏松症、骨坏死和骨折愈合障碍）的未满足需求（Shapiro等人，2019年）。从食品科学的角度来看，利用食品级益生菌（通常被认为是安全的，GRAS）来输送天然存在于芒果（Mangifera indica）中的植物化学物质（如芒果苷）是一种可持续且消费者可接受的方法，可用于减轻化疗引起的组织损伤。
芒果苷（MGF，1,3,6,7-四羟基黄酮-C2-β-D-葡萄糖苷）是一种天然C-葡萄糖基黄酮，在芒果（Mangifera indica）的叶子和树皮中含量丰富（Jyotshna等人，2016年）。MGF具有广泛的药理活性，包括抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，最新研究表明它能够通过激活Nrf2/HO-1、上调SIRT1和抑制NF-κB来保护细胞免受衰老（Imran等人，2017年；Saha等人，2016年）。然而，由于其口服生物利用度低（<2%）、快速的首过代谢、广泛的II期葡萄糖醛酸化和硫酸化以及较低的水溶性，MGF的临床应用受到限制（Fuentes-Rios等人，2025年；Tian等人，2016年），这些因素限制了其组织分布和治疗效果。来自乳酸菌（LAB），尤其是乳杆菌和Lactaseibacillus菌种的细胞外囊泡（EVs）作为天然纳米载体，具有独特的优势，适用于口服药物输送（Bitto等人，2017年；Liu等人，2018年）。与合成纳米颗粒不同，LAB EVs具有内在的胃肠道稳定性、低免疫原性和由蛋白质、脂质和核酸 cargo介导的生物活性（Behzadi等人，2017年；Li等人，2023年）。LAB EVs能够穿透肠上皮屏障，进入全身循环，并在目标器官中积累，使其成为输送难溶性植物化学物质的理想载体（Jones等人，2020年；Schaack等人，2024年）。除了作为输送工具外，LAB EVs还携带丰富的内源性效应蛋白，包括糖酵解旁系酶、分子伴侣和氧化还原调节因子，这些成分可以直接与人体细胞表面受体相互作用并调节细胞内信号通路（Bai等人，2011年；Zheng等人，2026年）。细菌培养条件可以重塑EV的蛋白质组，从而在单次发酵步骤中同时加载小分子 cargo并富集具有治疗意义的蛋白质。尽管取得了这些进展，但仍存在两个关键的知识空白：首先，大多数功能性研究将EV的生物活性视为整体现象，而没有明确哪些特定蛋白质 cargo分子作用于人类细胞。当EV在化合物补充条件下生成时，尚不清楚观察到的生物活性主要来源于加载的化合物、重塑的蛋白质 cargo还是它们的协同作用，这对基于机制的优化具有重要意义（Chen等人，2026年；Molina-Tijeras等人，2019年）；其次，目前尚不清楚益生菌EV的生物活性是所有乳杆菌菌株的共同特性还是仅限于某些特定菌株，这一问题很少通过系统比较同一物种的益生菌与非益生菌菌株的EV来进行探讨（Domínguez Rubio等人，2022年）。我们采用综合实验和蛋白质组学方法系统地分析了MGF和EV来源的效应蛋白对治疗效果的相对贡献，建立了一个基于总蛋白质浓度的标准化EV给药系统（BCA测定；EV蛋白质浓度50 μg/mL，包封的MGF浓度约为1.33 μg/mL，LE=2.66% w/w）。通过八组三菌株设计（PB-LR76、LGG ATCC 53103、L. rhamnosus ATCC 4356），我们评估了EV对人类MSC免受DOX诱导衰老的保护作用以及成骨和成软骨分化的维持能力。DIA-Hyper定量蛋白质组学分析（每组n=3）全面定义了蛋白质 cargo，并识别出MGF诱导的蛋白质组重塑，揭示了四个协调上调的抗衰老功能模块。通过系统性的PubMed交叉参考，我们将这些效应蛋白与26种已知具有细胞活性的益生菌EV效应蛋白类别进行对比，确定了赋予抗衰老功能的特定蛋白质，并将其映射到10个人类信号通路。我们的数据表明，PB-LR76 MGF EV的生物活性源于双重机制：MGF介导的药理效应加上蛋白质组水平的旁系酶、分子伴侣和氧化还原蛋白的富集，并证明这种活性具有益生菌菌株的特异性，为基于食品级EV的针对化疗引起组织损伤的治疗提供了理论依据。

部分内容
**细菌菌株和培养**
鼠李糖乳杆菌PB-LR76是从人类粪便样本中分离得到的。LGG（ATCC 53103）和L. rhamnosus ATCC 4356来自ATCC（弗吉尼亚州曼纳萨斯；分析证书见补充材料M2）。菌株在MRS培养基（Hopebio，青岛）中厌氧培养，温度为37°C。对于添加MGF的培养，MRS培养基中添加了100 μg/mL的MGF（纯度≥98%；Aladdin，上海），溶解在DMSO中（浓度≤0.1% v/v）。培养物在log生长后期收获（OD600约为1.2，培养时间为16-18小时）。菌株通过16S rRNA进行鉴定。

**EV制备和物理化学表征**
常规的Lac-EVs和PB-LR76 MGF EVs是从三种鼠李糖乳杆菌菌株（PB-LR76、LGG ATCC 53103、ATCC 4356）在标准MRS或MRS + 100 μg/mL MGF条件下培养得到的（图1）。透射电子显微镜（TEM）显示，这三种菌株的EV均为球形，具有膜边界（图2A）。动态光散射（DLS）分析显示，PB-LR76 EVs的直径约为200 nm，ATCC 4356 EVs约为150 nm，ATCC 53103 EVs约为180 nm，MGF的添加并未显著改变颗粒大小。

**讨论**
在鼠李糖乳杆菌PB-LR76培养物中添加芒果苷同时实现了药物加载（LE=2.66% w/w）并重塑了EV的蛋白质组，生成了多模块的抗衰老成分，保护MSC免受DOX引起的损伤，并保持了成骨和成软骨的分化能力。DIA-Hyper蛋白质组学分析（549种蛋白质，n=3）发现蛋白质组存在不对称重组：128种蛋白质富集，6种蛋白质减少，从而形成了四个协调上调的功能模块。

**结论**
总之，我们的研究发现表明，通过简单的共培养策略制备的PB-LR76 MGF EVs同时输送了MGF和多模块抗衰老蛋白 cargo，这些成分协调作用于DOX诱导衰老的MSC中的活性氧清除、DNA损伤信号传导、p53/p21通路激活、线粒体功能障碍、蛋白质稳态受损以及Smad介导的分化信号通路。通过DIA-Hyper定量蛋白质组学和系统文献回顾，我们证实了PB-LR76 MGF EV的生物活性。