不同灭活方法对Lactiplantibacillus plantarum dy-1后生物制品的影响：热处理可提高其可发酵性及调节巨噬细胞的潜力

《Food Bioscience》：Inactivation method-dependent differences in Lactiplantibacillus plantarum dy-1 postbiotics: heat treatment enhances fermentability and macrophage-modulating potential

　　摘要
后生元的功能受到用于微生物灭活的处理条件的强烈影响。然而，不同灭活方法在特定菌株后生元的结构和抗炎特性方面的差异仍不够清楚。在本研究中，通过95°C热处理（HI-dy-1）、121°C高压灭菌（AI-dy-1）和超声波处理（USI-dy-1）制备了Lactiplantibacillus plantarum dy-1来源的后生元。比较评估了它们的细胞形态、热行为、细胞相关脂肪酸甲酯（FAME）谱型、体外发酵能力以及相应发酵上清液的巨噬细胞调节活性。所有三种处理方法都消除了可检测的培养能力，但产生了不同的结构、物理化学和发酵特征。HI-dy-1在很大程度上保留了杆状细胞框架，并表现出表面粗糙化、可检测的高温热响应，以及与未经处理的dy-1更相似的细胞相关FAME指纹，而与其他灭活制剂不同。在体外结肠发酵过程中，HI-dy-1组产生的丙酸和丁酸浓度高于其他组，分别为1.97±0.02和2.57±0.13 mmol/L。相应的48小时发酵上清液（HI-dy-1-FS）在RAW264.7巨噬细胞中对LPS诱导的炎症反应具有最一致的抑制作用，分别将IL-6和NF-κB表达降低了约59.1%和77.6%。这种效果伴随着p65磷酸化的减少和IκBα丰度的恢复。总体而言，HI-dy-1部分保留了细胞框架，并且在结肠发酵过程中产生了比其他灭活制剂更高的丙酸和丁酸浓度。所得到的发酵上清液HI-dy-1-FS在测试条件下表现出最一致的巨噬细胞调节活性。这些发现表明，95°C热处理是制备dy-1来源后生元的一种有前景的处理条件，并为未来对其发酵产物的组分解析研究提供了基础。

引言
与活性益生菌相比，后生元作为食品相容的微生物制剂具有更好的稳定性和加工耐受性（Hill等人，2014年）。根据ISAPP的定义，后生元是无生命的微生物及其组分的制剂，能够为宿主带来健康益处（Salminen等人，2021年）。越来越多地认为，它们的生物活性不仅取决于活细胞的缺失，还取决于加工过程中产生的结构完整性、组分可及性和分子呈现方式（Pimentel等人，2023年；Zhu等人，2025年）。确定合适的灭活条件对于开发稳定和功能性的后生元成分非常重要。
灭活方法是一个关键的处理变量，决定了后生元制剂的结构表型和功能潜力。虽然热技术和非热技术都被用于后生元的生产，但不同的处理方法会导致微生物细胞损伤、组分暴露和细胞膜重塑的不同模式（Almada等人，2021年；Pimentel等人，2023年）。在本研究中，选择了三种代表性的灭活策略来反映不同的处理强度和损伤机制。95°C热处理是一种常用的热处理方法，可以通过对蛋白质、膜、核酸、核糖体和细胞膜结构的热损伤来消除微生物的培养能力，同时在受控条件下部分保留整体细胞框架和耐热表面相关组分（Cebrián、Condón和Ma?as，2017年；Russell，2003年）。121°C高压灭菌使细菌细胞暴露于饱和湿热和压力下，可能导致比传统热处理更广泛的大分子变性、细胞膜破坏和结构组织丧失（Cebrián等人，2017年）。相比之下，超声波是一种非热物理处理方法，主要通过声空化、剪切力、冲击波和微射流作用，导致细胞壁和细胞质膜的局部和异质性损伤（Chandrapala、Oliver、Kentish和Ashokkumar，2012年）。这些处理依赖的差异可能会改变细胞完整性、表面可及性和膜相关脂质指纹，从而影响免疫活性组分的暴露和后生元制剂的功能性能（Miao等人，2024年；Sun等人，2023年）。
在后生元报告的生物学功能中，调节肠道炎症引起了特别关注，因为无生命的微生物细胞及其结构组分可以与肠道相关免疫细胞相互作用并影响炎症反应（Mehta、Ayakar和Singhal，2023年；Yin等人，2023年）。乳酸菌的细胞膜相关分子，如肽聚糖、胞壁酸、脂壁酸、外多糖、表面蛋白和膜相关组分，可能作为微生物相关的分子模式参与宿主-微生物免疫通信（Bastos、Wheeler和Boneca，2021年；Chapot-Chartier和Kulakauskas，2014年）。巨噬细胞是重要的先天免疫细胞，参与微生物组分的识别和炎症介质的产生调节。因此，LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞模型被广泛用作体外系统来评估益生菌和后生元制剂的抗炎潜力（Lee、Jung、Lee和Paik，2024年）。在这个模型中，LPS刺激激活炎症信号通路并促进促炎介质的表达，包括TNF-α和IL-6、IL-1β，这与NF-κB通路的激活密切相关。因此，炎症基因表达的变化和IκBα/NF-κB激活的变化可以为评估后生元制剂的巨噬细胞调节活性提供有用的证据。
先前关于L. plantarum菌株的研究已经证明了活性菌株299v的胃肠道益处以及热杀死的L-137的免疫调节作用（Ducrotté等人，2012年；Tanaka等人，2020年）。比较和研究显示，不同L. plantarum菌株之间的免疫调节反应可能存在差异，并且可以通过热处理进行修改（Meijerink等人，2010年；Fujiki等人，2012年）。Lactiplantibacillus plantarum dy-1（L. plantarum dy-1）是一种源自发酵蔬菜的食品级乳酸菌，已存入中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC 6016）。在我们之前的研究中，直接比较了在相同藻酸钠递送条件下活菌和热灭活的L. plantarum dy-1。其热灭活制剂HI-dy-1通过改善肠道屏障功能、调节肠道微生物群落组成和增强短链脂肪酸的产生，显示出比活菌更强的整体保护作用（Yu、Zhu等人，2025年）。这些发现表明，L. plantarum dy-1来源的后生元可能具有作为食品相容制剂调节肠道炎症的潜力，并为进一步研究灭活条件如何影响其功能特性提供了直接的菌株特异性依据。使用相同的菌株进行不同的处理可以评估处理依赖的效果，同时最小化由于细菌遗传背景差异引起的混淆变化。然而，大多数关于dy-1来源后生元的证据都是基于热灭活细胞获得的，特别是95°C热处理得到的制剂，目前尚不清楚对同一菌株应用不同的灭活方法是否会生成具有不同结构特征和抗炎活性的后生元制剂。对这些处理依赖差异的更系统比较将有助于指导选择适合制备具有理想功能特性的L. plantarum dy-1来源后生元的灭活条件。
基于这些考虑，本研究比较了三种代表性的灭活方法，包括95°C热处理、121°C高压灭菌和超声波处理，用于制备L. plantarum dy-1来源的后生元。我们假设这些处理将产生不同的结构和物理化学表型，并伴随结肠发酵和发酵后巨噬细胞反应特征的差异。所得制剂在细胞形态、热行为和细胞相关脂肪酸甲酯（FAME）指纹方面进行了表征。进行了体外结肠发酵以比较短链脂肪酸的积累，同时使用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞模型评估相应发酵上清液的活性。本研究的目的是表征dy-1来源制剂之间的处理依赖性差异，并识别需要进一步组分水平研究的关联。

材料与试剂
Lactiplantibacillus plantarum dy-1（CGMCC 6016，L. plantarum dy-1）由江苏大学食品科学与工程学院实验室从泡菜中筛选出来，并存储在-80°C的冰箱中。RAW264.7巨噬细胞由中国科学院苏州生物化学与细胞生物学研究所提供。Cell Counting Kit-8（CCK-8）和qRT-PCR引物购自Shenggon Biotech有限公司（上海，中国）。RNA提取试剂盒购自CWBIO。

L. plantarum dy-1来源后生元的结构表型依赖于灭活方法
作为后续结构和功能评估的先决条件，首先检查了不同灭活处理后L. plantarum dy-1的培养能力。如图1A-D所示，未经处理的L. plantarum dy-1在MRS琼脂上形成了丰富的可见菌落，证实其可培养状态。相比之下，在相同的接种条件下，HI-dy-1、AI-dy-1或USI-dy-1未检测到可见菌落。TO/PI流式细胞术显示，PI阳性事件分别占99.1%、97.4%和...

结论
本研究表明，在测试条件下，不同的灭活方法产生了具有不同结构和脂质相关特征、体外结肠发酵谱型以及发酵后巨噬细胞调节活性的Lactiplantibacillus plantarum dy-1来源后生元。在所测试的处理方法中，95°C热处理产生的制剂部分保留了细胞框架，表面发生了改变...

作者贡献声明
Juan Bai：撰写 – 审稿与编辑。
Yansheng Zhao：撰写 – 审稿与编辑。
Xiang Xiao：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念化。
Qingqing Yu：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，调查，正式分析，数据管理。
Mengting Liu：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。
Ying Zhu：撰写 – 审稿与编辑。

未引用参考文献
Morrison和Preston，2016年；Yu等人，2025年。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。