《Food Chemistry: X》：Insight into functionality and bioactive properties of whey protein/beta-glucan complex discrepancy during different pH-induced phase transition
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本研究旨在阐明乳清分离蛋白(WPI)-燕麦β-葡聚糖(OBG)混合体系在pH诱导相转变过程中功能性与生物活性性质的差异。研究确定了四个代表性相区，包括pH 2.0共溶区(CSRpH2.0)、pH 5.5可溶性复合物区(SCRpH5.5)、pH 4.5不溶性复合
本研究旨在阐明乳清分离蛋白(WPI)-燕麦β-葡聚糖(OBG)混合体系在pH诱导相转变过程中功能性与生物活性性质的差异。研究确定了四个代表性相区，包括pH 2.0共溶区(CSRpH2.0)、pH 5.5可溶性复合物区(SCRpH5.5)、pH 4.5不溶性复合物区(ISRpH4.5)以及pH 7.0共溶区(CSRpH7.0)。处于CSRpH2.0的WPI-OBG混合物(WG)具有最高含量的不规则二级结构，其次依次为ISRpH4.5、SCRpH5.5和CSRpH7.0。处于SCRpH5.5的WG较处于ISRpH4.5的WG表现出更高的起泡性和乳化性。与其他相区相比，处于CSRpH2.0的WG表现出更优异的体外生物活性。主成分分析表明，处于CSRpH2.0的WG相较于其他相区的WG具有最高的综合得分。对不同相区蛋白质-多糖复合物功能性与生物活性差异的阐明，为其在食品工业中的靶向应用提供了关键的理论基础。
**论文解读：乳清蛋白/燕麦β-葡聚糖复合物在不同pH诱导相转变中的功能性与生物活性差异**
**1. 研究背景与问题提出**
蛋白质与多糖之间的非共价相互作用是构建具有增强功能性和生物活性复合物的有效策略。已有研究表明，大豆分离蛋白-多糖复合物的泡沫稳定性高于单一大豆分离蛋白；乳清分离蛋白(WPI)-银耳多糖复合物在pH 4.5条件下较单一WPI表现出显著更高的乳化活性指数和乳化稳定性指数；蒲公英多糖-WPI复合物的DPPH自由基清除能力较单一蒲公英多糖有所增强。此类通过非共价相互作用形成的蛋白质-多糖复合物已在食品工业中广泛用作乳液稳定剂、脂肪替代品、纳米封装材料和可食用膜。
蛋白质与多糖之间的非共价相互作用包括静电相互作用、氢键和疏水相互作用，这些作用力较弱且易受体系pH影响。随着pH变化，蛋白质-多糖混合体系会在热力学不相容的两相体系、单相复合凝聚体系以及单相共溶体系三种状态之间发生相转变。WPI约占乳蛋白的20%，主要包含β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和牛血清白蛋白，因其表面活性、高营养价值、良好的生物相容性和较低加工成本而被广泛用于pH诱导相转变研究。燕麦β-葡聚糖(OBG)是一种含多个羟基的线性多糖，具有高溶解度、高粘度和适宜静电电荷(pKa = 2.0–2.5)，且具有降胆固醇、预防糖尿病和调节肠道菌群等独特生物活性。
尽管前期工作已阐明WPI-OBG混合体系的pH诱导相转变机制，但不同相区（共溶区CSR、可溶性复合物区SCR和不溶性复合物区ISR）之间复合物在结构、功能性和生物活性方面的差异尚未明确。因此，本研究通过评价不同相区WPI-OBG复合物的结构、起泡性、乳化性、DPPH自由基清除能力、α-淀粉酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，旨在阐明不同相区之间的差异，为预测和设计具有靶向特性（如优异功能性或高生物活性）的蛋白质-多糖功能配料提供理论依据。
**2. 主要技术方法**
研究采用多种分析手段系统表征不同pH条件下WPI-OBG复合物的性质。WPI(93.77%)购自美国Mullins Whey公司，OBG(93%，Mw = 2.098×10
5 Da)购自中国陕西Benhe Bioengineering公司。通过紫外分光光度计测定浊度以确定相区边界；采用粒径与Zeta电位分析仪及激光粒径分析仪测定粒径(D50)和表面电荷；利用荧光分光光度计获取荧光光谱、表面疏水性和三维荧光光谱；通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合Peak-fit 4.12软件定量分析蛋白质二级结构；使用透射电子显微镜(TEM)观察微观形貌。功能特性方面，采用高速分散器发泡法测定起泡能力(FA)和泡沫稳定性(FS)；通过浊度法测定乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)。生物活性方面，分别采用DPPH法、DNS法和对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷法测定自由基清除能力、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。最后利用主成分分析(PCA)对多指标数据进行降维综合评估。
**3. 研究结果**
**3.1 pH诱导相转变区域的确定**
通过浊度分析，WPI-OBG混合体系(WG)在不同pH下呈现四个代表性相区：pH 6.3–7.0为共溶区(CSR)，因WPI与OBG均带相似负电荷产生静电排斥而抑制复合物形成；pH 5.3–6.3为可溶性复合物区(SCR)，体系浊度增加但未发生相分离；pH 2.9–5.3为不溶性复合物区(ISR)，在pH 4.5（接近WPI等电点）时浊度达最大值并伴随相分离；pH 2.0–2.9重新进入共溶区。选取pH 2.0(CSRpH2.0)、4.5(ISRpH4.5)、5.5(SCRpH5.5)和7.0(CSRpH7.0)分别代表各相区开展后续研究。
**3.2 粒径与Zeta电位分析**
WG在ISRpH4.5的粒径(D50)最大，其次为SCRpH5.5，CSRpH2.0和CSRpH7.0最低。在CSRpH2.0，OBG部分质子化带微弱正电荷，WPI也带正电荷，二者间静电排斥阻止相分离。在SCRpH5.5，WPI与OBG间静电排斥减弱，形成可溶性复合物并掩蔽表面电荷。在ISRpH4.5，WPI与OBG带相反电荷，通过静电吸引形成复合物，Zeta电位接近0导致聚集和不溶状态。在CSRpH7.0，二者均带强负电荷，静电排斥维持共溶状态。
**3.3 TEM分析**
透射电镜观察显示，WG在ISRpH4.5形成黑色不透明聚集体；在SCRpH5.5呈黑色絮状物质且分布较均匀，无大聚集体；在CSRpH2.0和CSRpH7.0因静电排斥为主要作用力，复合物聚集结构不明显。粒径顺序为ISRpH4.5 > SCRpH5.5 > CSRpH2.0 ≈ CSRpH7.0，与粒径测量结果一致。
**3.4 荧光光谱与表面疏水性**
WG的荧光强度按CSRpH2.0 > ISRpH4.5 > SCRpH5.5 > CSRpH7.0顺序递减。酸性条件促进蛋白质结构松散，暴露更多荧光基团(色氨酸)，而复合物形成会掩蔽荧光基团导致荧光猝灭。表面疏水性同样按此顺序排列，WG的疏水性显著高于单一WPI，表明添加OBG使蛋白质结构更灵活无序，暴露更多疏水基团。
**3.5 三维荧光光谱**
形成WPI-OBG复合物后荧光峰颜色变暗，表明WPI与OBG相互作用猝灭了内源荧光。不同相区峰色由深至浅依次为CSRpH2.0 > CSRpH7.0 > SCRpH5.5 > ISRpH4.5，这与复合物聚集程度相关。ISRpH4.5时复合物紧密结合减少了可检测的发光基团，而共溶区因排斥作用复合物形成较少，发光基团未被掩蔽。
**3.6 FTIR分析**
WG在1700–1600 cm
-1的峰位较WPI向低波数移动，表明WPI与OBG间存在静电相互作用；在3400–3200 cm
-1向高波数移动（蓝移），表明OBG竞争结合水分子削弱了氢键网络。二级结构定量分析显示，WG在CSRpH2.0具有最多无序结构（β-转角和无规卷曲），其次为ISRpH4.5、SCRpH5.5和CSRpH7.0，酸性条件促进了WPI的去折叠。
**3.7 起泡性质**
WG的起泡能力(FA)和泡沫稳定性(FS)均显著高于单一WPI或OBG。WG结构更灵活，可通过快速结构重排暴露更多疏水位点，促进其在气-水界面的吸附；多糖的引入还提高了体系粘度，减缓了泡沫排水和粗化。不同相区中，SCRpH5.5的起泡性优于ISRpH4.5，归因于后者粒径更大导致向气-水界面的扩散速率降低。CSRpH2.0的起泡性优于CSRpH7.0，因前者暴露了更多疏水基团，增强了与气-水界面的疏水相互作用。
**3.8 乳化性质**
WG的乳化活性指数(EAI)高于单一WPI或OBG，因WG表面疏水性更高，促进了与油滴的疏水相互作用。SCRpH5.5的EAI优于ISRpH4.5，因前者粒径较小，比表面积和扩散速率更高。SCRpH5.5的乳化稳定性指数(ESI)高于共溶区，归因于较大的可溶性复合物聚集体提高了乳液粘度，限制了油滴迁移和聚结。ISRpH4.5的ESI最低，因Zeta电位绝对值最低，油-水界面静电排斥不足。
**3.9 抗氧化性质与酶抑制活性**
WG在CSRpH2.0的DPPH自由基清除能力显著高于SCRpH5.5和CSRpH7.0，因强酸条件下暴露了更多芳香族氨基酸侧链（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），这些残基可提供氢原子灭活自由基。WG对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性均显著高于单一组分，且按CSRpH2.0 > ISRpH4.5 > SCRpH5.5 > CSRpH7.0顺序递减。CSRpH2.0的WG暴露了更多疏水性氨基酸残基（如亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸），可与酶活性位点结合从而抑制酶活性；WG的高粘度也阻碍了酶扩散和酶-底物接触。
**3.10 PCA与热图分析**
主成分分析中PC1、PC2和PC3分别反映总信息的36.9%、26.1%和19.6%。WG在CSRpH2.0和SCRpH5.5位于第一象限，ISRpH4.5位于第八象限，CSRpH7.0位于第九象限，表明不同相区间功能性和生物活性存在差异。CSRpH2.0的WG综合得分最高。热图分析进一步直观显示，SCRpH5.5的WG具有最高起泡性和乳化稳定性，CSRpH2.0的WG具有最强的DPPH自由基清除能力及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，CSRpH7.0的WG乳化活性指数最高。
**4. 讨论与结论**
研究表明，pH诱导的相转变显著影响WPI-OBG复合物的结构、功能性和生物活性。不同相区复合物表现出差异化的性能优势：SCRpH5.5有利于起泡和乳化稳定性，CSRpH2.0有利于体外生物活性。主成分分析综合评估表明CSRpH2.0的WG综合表现最佳。这些发现为设计具有靶向特性的蛋白质-多糖功能配料提供了理论基础。然而，不同相区WG的优势尚需在多样化食品基质中的实际应用中进行验证。后续工作将研究蛋白质-多糖非共价复合物作为稳定剂或功能配料的实际应用，以期获得具有优异性能的食品。该论文发表在《Food Chemistry: X》。
