《Food Chemistry: X》：Machine learning modeling for optimizing fermentation process of
Dendrobium officinale with improved antioxidant property and metabolic changes
编辑推荐：
摘要
乳酸菌（LAB）发酵可能影响化学可及性，并可开发铁皮石斛（DO）的抗氧化特性。本研究将九种机器学习（ML）算法与响应面法（RSM）相结合，以优化多酚富集。XGBoost成为最优预测模型（R2＝0.982±0.006，RMSE＝2.92±0.076，MAE
摘要
乳酸菌（LAB）发酵可能影响化学可及性，并可开发铁皮石斛（DO）的抗氧化特性。本研究将九种机器学习（ML）算法与响应面法（RSM）相结合，以优化多酚富集。XGBoost成为最优预测模型（R2＝0.982±0.006，RMSE＝2.92±0.076，MAE＝2.35±0.062），显著优于二次RSM模型。LAB发酵有效增强了生物活性小分子的产生和自由基清除活性（DPPH和ABTS），且在所测试的体外条件下不降低细胞活力。非靶向代谢组学鉴定了深刻的代谢重塑，其特征为31种类黄酮（ notably 3-羟基黄酮）的上调以及生物活性酚酸如1,3-二咖啡酰奎尼酸的富集。重要的是，发酵显著重塑了生物碱代谢，包括斯巴丁-5-醇和安贝林。这些结果表明，ML引导的发酵是药用与食用同源资源功能化增值的一种有前景的策略，并为发酵过程优化提供了数据驱动的框架。
**论文解读：基于机器学习建模的铁皮石斛发酵工艺优化及其抗氧化性能与代谢变化研究**
**一、研究背景与问题提出**
铁皮石斛（*Dendrobium officinale*，DO）作为一种兼具药用与食用价值的药食同源（MFH）植物资源，因其多样的药理活性而备受关注，包括免疫调节、抗氧化及降血糖等作用。近年来，随着消费者对天然健康成分需求的日益增长，铁皮石斛的开发利用已从传统药用延伸至功能性食品和营养保健品领域。多糖被认为是其主要生物活性成分，而多酚、生物碱及联苄类化合物也在调节多种生理通路中发挥重要作用。然而，铁皮石斛的实际应用常因其生物利用度较差而受限，尤其是其多糖分子量大、结构复杂，这些理化特性限制了吸收并降低了生物功效，对开发高附加值食品与健康产品构成重大挑战。因此，亟需创新的加工策略来修饰结构特性、促进生物活性组分释放并提升整体生物活性。
微生物发酵已成为一种高效、环境友好且可持续的生物加工手段，可增强食品原料的功能特性。乳酸菌（LAB）作为公认安全的益生菌，在发酵中展现出显著潜力。LAB可产生一系列水解酶，通过降解植物细胞壁促进胞内化合物的释放，并将大分子多糖转化为更易被生物利用的小分子片段。此外，发酵可生成新的代谢物或增强现有化合物的抗氧化及生物学特性，从而提升发酵产物的营养与功能价值。响应面法（RSM）与机器学习（ML）近年来已被广泛应用于食品科学领域的实验研究。RSM通过数学模型描述受控实验因素与观测结果之间的关系；ML则类似于生物神经系统，通过并行计算处理信息，对生物数据分析极具价值。然而，尽管已有初步研究探讨了铁皮石斛的发酵，但多集中于发酵前后生物活性的简单比较，缺乏对发酵参数与成分结果之间定量关系的系统研究。传统工艺优化方法如RSM存在固有局限性，难以捕捉复杂生物系统中的非线性和多变量相互作用。ML算法为此提供了有力替代方案，能够构建预测模型并实现对非线性、多变量相互作用的全局优化。然而，ML在食品发酵研究中的整合应用，特别是针对药食同源植物原料，仍处于起步阶段。因此，建立高精度的数据驱动框架以同时处理复杂菌株相互作用和多因素加工变量，是超越经验性试错法的关键需求。
**二、研究目标与关键方法**
本研究旨在建立一种整合LAB发酵与数据驱动建模的综合策略，以优化铁皮石斛的生物加工过程。研究设置了三个主要目标：（i）利用ML优化发酵工艺；（ii）验证发酵铁皮石斛（DOF）增强的抗氧化活性；（iii）阐明这些功能改善背后的主要代谢组学变化。研究人员采集自湖南省新宁县当地种植合作社的新鲜铁皮石斛茎，经中国科学院植物研究所罗毅波教授团队分类学鉴定确认。所用菌株为植物乳杆菌（*Lactobacillus plantarum*，CGMCC No. 18260）、副干酪乳杆菌（*Lactobacillus paracasei*，AUY19024）和鼠李糖乳杆菌（*Lactobacillus rhamnosus*，AU19260），均来源于湖南农业大学食品科学与技术学院。研究采用两阶段发酵实验设计：第一阶段进行五因素五水平单因素实验，考察发酵温度、时间、液料比、接种量及混合菌株比例对总多酚含量的影响；第二阶段采用基于RSM的Box-Behnken设计确定显著变量的最优水平及交互作用。在建模方面，研究构建了九种ML算法，涵盖基于树的集成模型（XGBoost、梯度提升、随机森林、Extra Trees、AdaBoost）、正则化线性模型（岭回归、弹性网络）及核方法（支持向量回归SVR、K近邻kNN）。数据预处理中，针对菌株比例这一成分数据，采用中心对数比（CLR）变换以消除闭合效应带来的伪相关。模型性能通过重复5折交叉验证进行评估，以决定系数（R2）、均方根误差（RMSE）和平均绝对误差（MAE）为评价指标。此外，采用Folin-Ciocalteu比色法测定总酚含量，通过Caco-2和HepG2细胞系进行体外细胞毒性初步评估，采用DPPH和ABTS自由基清除实验评价抗氧化活性，并利用LC-MS/MS进行非靶向代谢组学分析。
**三、主要研究结果**
**3.1 单因素对多酚产量的影响**
单因素实验结果显示，发酵温度对多酚形成具有显著调节作用，37°C时出现明显峰值，表明该温度有利于酶促催化和微生物增殖；超过40°C后多酚含量显著下降，归因于热应激损害细菌生长和酶稳定性。发酵时间从24小时延长至48小时逐渐增强多酚输出，60小时达到最大产量，但延长至72小时导致明显降低，可能与营养耗尽、代谢反馈或多酚降解有关。接种量从1%增加至4%时多酚水平快速上升，进一步增至8–10%仅产生轻微增加，表明系统接近代谢饱和。液料比呈现明显单峰行为，25 mL/mg时产量最高，过高稀释度降低浓度梯度和提取驱动力。
**3.2 菌株比例对多酚产量的影响**
菌群组成对多酚产量产生显著影响。当植物乳杆菌:副干酪乳杆菌:鼠李糖乳杆菌比例为0.667:0.167:0.167时获得最高多酚水平（84.553 μg/mL），其次为副干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌以0:0.5:0.5组合（82.059 μg/mL）。混合培养整体优于单一菌株发酵，植物乳杆菌占主导比例或副干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌共存可产生最优发酵性能。
**3.3 RSM分析**
基于Box-Behnken设计的二次模型统计显著，但调整决定系数较低（0.8543）且失拟项处于临界值（p＝0.0501），表明响应行为可能涉及比二阶模型更复杂的非线性模式。发酵温度影响最大，其次为菌株比例和发酵时间，液料比贡献最小。显著的交互作用出现在温度-时间（AB）、温度-液料比（AC）、时间-菌株比例（BD）和液料比-菌株比例（CD）之间，强调发酵参数间的相互依赖性。RSM虽能识别关键变量并提供初步优化趋势，但固定二次多项式模型可能无法完全表征系统复杂性。
**3.4 ML模型性能比较**
相关性分析显示，CLR变换后的成分特征呈现强负相关，证实CLR变换有效缓解闭合效应；发酵温度、时间与液料比之间弱相关，表明实验设计中因子独立性良好。主成分分析（PCA）显示前两个主成分仅解释约50.1%的总方差，未观察到按多酚水平划分的清晰样本分离，揭示了线性模型在捕捉多酚形成机制方面的固有局限性。性能比较结果表明，所有ML模型在测试集上的R2值均高于RSM（R2＝0.927）。XGBoost表现最优，R2＝0.982±0.006，RMSE＝2.920±0.076，MAE＝2.350±0.062；SVR也展现出较强预测性能（R2＝0.978±0.004）。XGBoost和SVR的预测值紧密聚集于理想拟合线周围，覆盖多酚浓度全范围且无明显系统偏差。XGBoost的优异性能归因于其将梯度提升与正则化相结合，能有效捕捉高阶交互作用同时控制过拟合。
**3.5 最优条件验证**
RSM确定的最优发酵参数为温度37.68°C、时间38.871小时、液料比21.347:1、混合接种比例0.667:0.167:0.167，理论多酚含量预测为87.39 μg/mL。实验验证在调整条件（37°C、38小时、液料比21:1）下测得多酚浓度为82.74±0.574 μg/mL，偏差为5.32%。XGBoost模型预测的最优条件为37.12°C、49.37小时、25.831:1比例，对应理论值85.94 μg/mL；验证实验测得83.74±0.574 μg/mL，偏差仅2.56%。两种模型的预测偏差均低于10%，但XGBoost模型偏差更小，预测精度更优，故采用其推荐条件进行后续实验。
**3.6 体外细胞活力评估**
在Caco-2和HepG2细胞系中进行的初步细胞毒性评估显示，在0.25–4 mg/mL浓度范围内，DOF未对任一细胞系产生显著细胞毒性，细胞活力始终保持在未处理对照的90%以上，表明DOF在所测试的体外条件下无检测到的细胞毒性。
**3.7 发酵驱动的多酚及酚类物质增强DOF抗氧化特性**
DPPH自由基清除实验中，DOF在整个测试浓度范围内均表现出比DO更强的清除活性，IC??值（1.368 mg/mL）显著低于DO（3.332 mg/mL），表明发酵样品在清除DPPH自由基方面具有更高反应效率。ABTS自由基清除实验中，DOF在较低浓度即实现较高清除率，IC??值（0.5835 mg/mL）显著低于DO（1.835 mg/mL），进一步证明发酵增强了样品的整体供电子能力。ABTS体系对结构多样、极性范围广泛的抗氧化剂更为敏感，DOF在ABTS测定中IC??更显著的降低表明LAB发酵可能优先促进易发生电子转移反应的多酚组分的富集或释放。
**3.8 非靶向代谢组学分析**
**3.8.1 DO与DOF的代谢差异分析**
PCA分析显示DO与DOF沿PC1（解释78.13%总方差）明显分离，DOF样品聚类更紧密，表明发酵后代谢均匀性提高。PLS-DA模型实现了DO与DOF的完全分离，模型指标R2X＝0.608、R2Y＝0.998、Q2＝0.967，表明模型可靠且过拟合风险极小。OPLS-DA S图鉴定出位于极端位置的离子为潜在的发酵响应代谢物，提示发酵过程中发生定向生化转变，如糖苷键断裂或酚类释放。
**3.8.2 发酵对铁皮石斛类黄酮的影响**
在39种显著差异类黄酮中（VIP>1，P<0.05），31种在DOF中相对DO上调，8种下调。3-羟基黄酮、6-羟基黄酮和3′,5′-二羟基黄酮等黄酮和黄烷醇苷元在发酵后大量积累，其中3-羟基黄酮增幅最大（Log?FC＝5.87）。甘草查尔酮A和8-香叶基白杨素等异戊烯基类黄酮显著富集，表明发酵促进植物基质中紧密结合的亲脂性类黄酮的释放或转化。相反，多种高度糖基化或酰基化的类黄酮如槲皮素3-O-(6″-乙酰基-葡萄糖苷)和花翠素3-半乳糖苷显著减少，与发酵过程中酯酶活性去除复杂类黄酮酰基一致。
**3.8.3 发酵对铁皮石斛酚酸的影响**
近70%检测到的酚酸及相关苯丙素类化合物含量增加，1,3-二咖啡酰奎尼酸（Log?FC＝9.64）、水杨苷（5.06）、aspulvinone H（4.04）、darendoside A（2.21）和二甲氧基姜黄素（3.50）等高度取代衍生物显著积累。同时，3-羟基肉桂酸（Log?FC＝?9.03）、异丁香酚（?7.09）、肉桂酸（?7.33）和1-咖啡酰奎尼酸（?6.25）等简单羟基肉桂酸大幅下降，表明这些前体被积极整合到下游共轭产物中。
**3.8.4 发酵对铁皮石斛生物碱的影响**
超过一半定量到的生物碱显著减少，尤其是斯巴丁-5-醇（Log?FC＝?9.67）、安贝林（?8.92）、辣椒素（?6.14）、马钱子碱（?7.09）、紫杉醇C（?6.16）和藜芦定（?6.46）等二萜类和甾体生物碱。同时，napelline（7.10）、dimethamine（6.91）、nonivamide（5.82）、cardiopetalidine（6.78）和unicine A（5.50）等大量吲哚型和小分子生物碱显著增加，表明LAB发酵可能影响特定生物碱转化途径。
**四、讨论与结论**
本研究表明，LAB发酵有效提升了铁皮石斛的多酚含量和抗氧化活性。ML模型与RSM被成功应用于关键发酵参数的多酚含量优化，其中XGBoost模型展现出最优预测性能。非靶向代谢组学证实LAB发酵诱导了协调的代谢重塑，其特征为类黄酮向苷元和低分子量衍生物转变，以及酚酸代谢的定向变化，为增强的抗氧化活性提供了生化基础。此外，发酵显著重塑了生物碱谱，包括多种先前报道具有毒性相关特性的生物碱减少，进一步证明了LAB发酵的广泛代谢影响。总体而言，本研究建立了ML引导的发酵策略，将工艺优化与代谢组学表征相结合，为提升铁皮石斛及其他药食同源植物资源的功能品质提供了机制框架。研究也存在一定局限性：数据集仅含59个实验组，预测模型应视为探索性结果，需在更大规模独立数据集中进一步验证；代谢组学分析主要基于相对代谢物变化和数据库注释，所指示的关联性而非直接因果机制，代表性代谢物的结构和绝对浓度需使用真实标准品和靶向定量方法进一步确认；总黄酮含量未通过验证的定量方法直接测定；Caco-2和HepG2细胞实验仅为初步体外证据，尚不能确定发酵产品的一般安全性或长期耐受性。
