低分子量配体决定了铜(II)在啤酒中的结合行为

《Food Chemistry》：Low molecular weight ligands govern Cu(II) binding in beer

　　• 通过标准添加的低温EPR技术揭示了啤酒中铜的氧化态。啤酒中的铜以Cu(I)和Cu(II)的形式存在，其中约36%为Cu(II)。大部分Cu(II)与内源性配体结合，只有微量处于游离状态。测得丙氨酸、酪氨酸和草酸是Cu(II)结合的主要贡献者。配体的配位影响铜的氧化还原活性，并对啤酒中的巯基稳定性产生影响。

引言
全球啤酒工业对全球经济的影响超过8780亿美元，该行业投入了大量时间和精力来优化和标准化其产品，以达到所需的风味目标（Ditrych等人，2025年；Oxford Economics和World Brewing Alliance，2025年）。啤酒是一种由麦芽大麦和/或非大麦谷物辅料、啤酒花、水和酵母制成的产品，其成分非常复杂，在最终成品状态下本质上是不稳定的（Bamforth和Lentini，2009年；Ditrych等人，2025年）。特别是在储存过程中，氧化反应（如啤酒变质）是导致啤酒风味和香气降解的主要原因（Bamforth和Lentini，2009年；Mertens等人，2022年）。这些有害反应由来自酿造原料以及酿造设备和包装材料的痕量过渡金属（如铜、铁和锰，浓度<50μg/L）催化。痕量的过渡金属通过芬顿反应、类似芬顿的反应以及哈伯-魏斯反应生成活性氧物种（O??、HO??、H?O?、·OH），从而引发对啤酒质量不利的氧化过程（Bamforth和Lentini，2009年；Hashimoto，1972年；Mertens等人，2022年；Pohl，2009年）。虽然氧化仍然是影响啤酒风味稳定性的主要途径，但最近的综述指出，美拉德反应和斯特雷克尔反应产生的醛类物质也对啤酒变质有显著影响，这突显了风味恶化的多因素性质（Ditrych等人，2025年）。

在氧化和非氧化降解途径的背景下，啤酒花中含有的多功能巯基化合物（如3-巯基己醇（3MH）、3-巯基己基醋酸酯（3MHA）和4-甲基-4-巯基戊烷-2-酮（4MMP）是一类特别容易被铜氧化的香气活性分子。这些巯基化合物通常以微摩尔浓度存在，为许多现代啤酒风格赋予水果和热带风味（例如百香果、番石榴、葡萄柚、黑醋栗），并且它们的感官阈值极低（ng/L）（Ditrych等人，2025年；Pohl，2009年；Shellhammer和Lafontaine，2019年；Vermeulen等人，2006年）。然而，这些化合物化学性质不稳定，在储存过程中会因暴露于氧气、温度波动以及与痕量金属的相互作用而迅速减少（Mertens等人，2022年）。铜被证明是巯基降解的强驱动因素，因为它容易与巯基结合，并促进其氧化为无味的二硫化物和多硫化物（Bailly等人，2009年；Bekker等人，2018年；Clark等人，2015年；Kreitman等人，2016年；Walker，1995年）。我们目前对铜与多功能巯基相互作用的机制理解主要来自葡萄酒系统的研究，但最近的研究表明类似反应也发生在麦汁和啤酒中（Kishimoto，2009年；Kishimoto等人，2008b；Kishimoto等人，2008a；Lermusieau和Collin，2003年；Morimoto等人，2010年；Pagenstecher等人，2021年；Vincent等人，2025年）。

啤酒中含有复杂的化学环境，这会影响铜的存在形式和反应方式。我们团队及其他研究者的最近研究表明，麦芽衍生的肽类物质（如甘氨酰-组氨酸（Gly-His）可以螯合Cu(II)，从而降低其对巯基的活性，从而保护啤酒花的香气（Pagenstecher等人，2021年；Vincent等人，2025年）。这些发现强调了识别啤酒中内源性铜结合配体、确定Cu(I)和Cu(II)的分布以及阐明这种形态如何影响巯基稳定性的重要性。

在这项研究中，我们结合了电子顺磁共振（EPR）光谱技术和离子选择性电极（ISE）滴定法来研究商业啤酒中铜的形态。这两种互补的技术使我们能够量化Cu(I)和Cu(II)的相对含量，区分游离态和结合态的Cu(II)，并识别负责铜结合的配体。通过表征这两种氧化态及其结合环境，我们提供了啤酒中铜分布的全面视图。从分子水平上了解铜的行为对于确定有多少铜可用于氧化还原反应（尤其是那些会降解啤酒花中多功能巯基的反应）至关重要。这些见解将为限制铜引起的啤酒变质和提高啤酒风味稳定性提供机制基础，特别是对于以啤酒花为主要香料的啤酒风格。

材料
4-甲基-巯基戊烷-2-酮（4MMP）、3-巯基-1-己醇（3MH）、3-巯基己基醋酸酯（3MHA）、硝酸铜（≥99.99%纯度，以痕量金属计）、L-半胱氨酸、甘氨酰-组氨酸盐酸盐（Gly-His）、硝酸钾（≥99.99%纯度，以痕量金属计）、过硫酸铵（APS）、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸（EGTA）、L-丙氨酸、L-酪氨酸、草酸、乳酸、丙酸、琥珀酸和Trizma盐酸盐均从Sigma-Aldrich购买。

通过低温EPR测量啤酒中的Cu(I)与Cu(II)
我们之前已经证明EPR光谱技术能够直接检测顺磁性Cu(II)，而不能检测抗磁性Cu(I)，为区分啤酒中的铜氧化态提供了一种有效方法（Vincent等人，2025年）。在此基础上，本研究探讨了添加的Cu(II)如何与啤酒成分相互作用，从而改变其形态及其反应性。

实验方法
向含有过量EGTA的啤酒样品中加入已知浓度的Cu(NO?)?，以形成单一的Cu(II)形式。

结论
综合这些结果表明，啤酒中含有Cu(I)和Cu(II)两种形式的铜。通过在液氮环境下进行标准添加Cu(II)并通过ICP–MS分析，我们确定约36%的铜以Cu(II)形式存在。这种Cu(II)主要以结合态存在，主要与相对低分子量的配体结合——主要是氨基酸和有机酸。分离实验和模型系统进一步支持了这一结论。

作者贡献声明
Morgan A. Vincent：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、概念化。
Mogens L. Andersen：撰写——审稿与编辑、验证、监督、方法学、研究、概念化。
Morten J. Bjerrum：撰写——审稿与编辑、可视化、验证、监督、方法学、研究、正式分析、概念化。
Alexey Silakov：撰写——审稿与编辑、可视化。

资助
本项工作部分得到了宾夕法尼亚州农业部通过宾夕法尼亚麦芽和酿造饮料产业促进计划对R. Elias的技术援助资助。此外，该项目还得到了美国农业部国家食品和农业研究所对R. Elias的联邦拨款支持（项目编号PEN05007，访问号7007356）。

利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢
作者感谢阿德莱德大学农业科学系的Dave Jeffery在构思原始项目方面提供的帮助和宝贵意见。

作者名单：Morgan A. Vincent | Mogens L. Andersen | Morten J. Bjerrum | Alexey Silakov | Ryan J. Elias