《Food Chemistry》：Effects of Spinosin on nonenzymatic glycation of β-lactoglobulin: A mechanism study based on multi-spectroscopy analysis and molecular docking
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•刺槐素是一种优良的抗糖基化剂。•糖基化过程中形成了交联结构和β-淀粉样蛋白。•通过分子对接分析确定了刺槐素保护的糖基化位点。•刺槐素通过静态猝灭机制猝灭β-乳球蛋白的荧光。引言美拉德反应（MR）有助于热加工食品中各种质量属性（特别是颜色和风味）的形成（Mirza Aliza
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刺槐素是一种优良的抗糖基化剂。
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糖基化过程中形成了交联结构和β-淀粉样蛋白。
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通过分子对接分析确定了刺槐素保护的糖基化位点。
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刺槐素通过静态猝灭机制猝灭β-乳球蛋白的荧光。
引言
美拉德反应（MR）有助于热加工食品中各种质量属性（特别是颜色和风味）的形成（Mirza Alizadeh 等，2025），但它也会产生一系列有害化合物。这些包括杂环芳香胺（HAAs）、晚期糖基化终末产物（AGEs）、5-羟甲基糠醛（HMF）和丙烯酰胺（AAs）（Kathuria 等，2023）。其中，AGEs 是一类主要的 MR 衍生副产物，对人类健康构成重大威胁。AGEs 的形成源于还原糖的羰基与氨基酸、肽或蛋白质的游离氨基之间的非酶促反应（Twarda-Clapa 等，2022）。该反应始于还原糖（如葡萄糖）与游离氨基的缩合，形成不稳定的希夫碱，随后发生脱水和重排生成 Amadori 产物。进一步反应生成高反应活性的α-二羰基化合物（α-DCs），如 3-脱氧葡糖酮（3-DG）、乙二醛（GO）和甲基乙二醛（MGO）（Degen 等，2012；Wang, Xie 等，2022）。这些高反应活性的α-DCs 随后可与蛋白质中的赖氨酸和精氨酸残基反应，最终形成稳定的 AGEs（Gobert & Glomb, 2009）。
牛奶和乳制品富含蛋白质、脂肪和碳水化合物等宏量营养素，以及钙、镁、硒、锌、维生素 B12 和维生素 B5 等各种微量营养素。它们是日常营养的重要来源，并已被许多国家的官方饮食指南推荐。然而，在乳制品的实际加工过程中，特别是在巴氏杀菌、超高温（UHT）灭菌和喷雾干燥等热处理过程中，会发生 MR，导致晚期糖基化终末产物（AGEs）的形成。乳制品中的碳水化合物、氨基酸和脂质成分均为 AGEs 形成的关键前体。具体而言，碳水化合物与氨基酸反应生成 Amadori/Heyns 产物和二羰基化合物，最终导致 AGEs 形成。同时，脂质过氧化产生的二羰基化合物也加速了 MR，进一步促进 AGEs 的形成（Dong 等，2023）。因此，乳制品的组成特性为 AGEs 的形成提供了有利的基质基础，而热处理显著驱动了这一化学过程。此外，作为日常饮食的重要组成部分，乳制品是膳食 AGEs 的主要来源。一旦被摄入，这些 AGEs 会逐渐积累在各种人体器官中。这种积累诱导蛋白质交联，从而改变蛋白质结构并损害正常生理功能（Kosmopoulos 等，2019）。此外，长期暴露于 AGEs 会激活其特异性受体（RAGE），促进氧化应激和炎症反应。这一级联反应随后促成了糖尿病并发症、心血管疾病和神经退行性疾病等慢性疾病的发展和进展（Kosmopoulos 等，2019）。因此，抑制 AGEs 的形成对于这些疾病的预防和管理至关重要。
文献中已广泛报道了许多抗糖基化剂，如氨基胍（AG）、苯福生和吡哆胺。然而，它们的潜在应用往往受到显著副作用和毒性的限制，这对人类健康构成风险（X. Peng 等，2011）。相比之下，源自天然产物的 AGEs 抑制剂被认为是一种有前景的替代策略，因为其副作用较小且具有成本效益。大量研究表明，天然成分——包括酚酸、黄酮类化合物和单宁，这些成分在蔬菜和水果等常见食品中含量丰富——可以通过多种途径抑制 AGEs 的形成（Anwar 等，2021）。例如，杨梅素及其衍生物可以通过氢键和其他分子间相互作用屏蔽糖基化位点，显著抑制果糖胺和α-二羰基化合物（α-DCs）的形成（Y. Wang 等，2024）。阿魏酸不仅能通过占据蛋白质糖基化位点有效抑制糖基化过程，还能减少该过程中发生的氧化修饰（Liu 等，2018）。大蒜素通过双重机制发挥抗 AGEs 和抗糖尿病作用：在化学层面，它通过清除α-DCs 直接抑制 AGEs 形成，抑制果糖胺形成，减少果糖胺向α-DCs 的转化，并以浓度依赖的方式抑制荧光性 AGEs 的生成，同时也通过分子间相互作用保护蛋白质糖基化位点（Li 等，2022）。
在上述机制中，刺槐素（SP）可能通过抑制果糖胺和α-DCs 的形成以及占据蛋白质糖基化位点来抑制蛋白质糖基化。SP 是从酸枣仁中分离出的一种 C-糖苷黄酮，其结构特征为黄酮骨架连接二糖部分。其 C-糖苷键和疏水性黄酮骨架提供了优异的化学稳定性和空间位阻效应，驱动其与蛋白质的疏水区域结合，并可能使其能够占据和保护糖基化位点。此外，SP 分子中的一系列酚羟基可能与蛋白质氨基酸残基相互作用形成氢键，从而增强对糖基化位点的亲和力和结合调节的灵活性。同时，C-6 处的二葡萄糖侧链有助于进一步增加空间位阻，表明可能存在覆盖蛋白质表面多个糖基化位点的屏蔽效应，从而降低糖基化修饰的概率。此外，许多研究报告称 SP 具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、镇静、催眠、增强认知、抗癌和抗焦虑作用（Kuang 等，2022）。鉴于这些广泛的药理特性及其独特的化学结构，SP 可能在抑制 AGEs 形成方面具有潜在价值。然而，迄今为止，尚无研究系统地调查 SP 的抗糖基化功效或阐明其潜在分子机制。
β-Lg 是牛乳清蛋白的主要成分，约占乳清蛋白总量的 50–55% 和牛乳蛋白总量的 10–15%。由于其高营养价值和独特风味，它被广泛用于各种食品中，包括婴儿配方奶粉、烘焙食品和饮料。然而，在加工过程中，乳蛋白经常发生非酶促糖基化形成 AGEs，这对人类健康构成风险。基于此，本研究选择β-Lg 作为目标蛋白，建立了三种糖基化模型系统，β-Lg-Glu、β-Lg-GO 和β-Lg-GA，以研究 SP 的抗糖基化活性及其潜在机制。首先，评估了早期、中期和晚期 AGEs 的形成，以及与蛋白质官能团和氧化修饰相关的指标。此外，使用紫外 - 可见（UV–Vis）吸收光谱、荧光光谱、傅里叶变换红外（FTIR）光谱和硫黄素 T（ThT）荧光测定法研究了 SP 对蛋白质二级结构的保护作用。值得注意的是，采用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定 SP 处理后糖基化蛋白质的分子量。分子对接预测了 SP 与蛋白质的结合模式，揭示了其可能结合的氨基酸残基，从而可能通过空间位阻或占据来保护潜在的糖基化位点。此外，使用荧光光谱计算了 SP 与β-Lg 之间的结合动力学。这些发现为阐明 SP 抑制 AGEs 形成的分子机制提供了理论依据，并为其作为天然抗糖基化剂的开发和应用提供了数据支持。
章节摘要
材料
SP 标准品购自北京贝克伦康（北京，中国）（纯度≥98%）。β-乳球蛋白（β-Lg）（纯度≥95%，源自牛乳）、硝基四氮唑蓝（NBT）、5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、ThT 和 2-硫代巴比妥酸购自阿拉丁（上海，中国）。GO 购自源叶（上海，中国）。葡萄糖（Glu）和磷酸盐缓冲液（PBS）购自百奥拓普（北京，中国）。乙醇醛（GA）、AG、2,4-二硝基苯肼
糖基化系统的表征
AGEs 是在 MR 的高级阶段通过一系列复杂的化学反应形成的。这个阶段产生黑精素，这是一种棕色色素，其含量与 MR 的程度直接相关（Semedo Tavaares 等，2018）。如图
1D-F
所示，天然β-Lg 呈无色透明溶液，而糖基化β-Lg 表现出不同程度的褐变。这一观察结果表明在糖基化过程中形成了棕色色素，导致可见的颜色变化
结论
本研究系统评估了 SP 的抗糖基化活性。通过建立体外β-Lg-Glu、β-Lg-GO 和β-Lg-GA 糖基化模型系统，并采用包括 FTIR、ThT 染色、荧光光谱和分子对接在内的分析技术组合，阐明了 SP 抑制 AGEs 形成的潜在机制。结果表明，SP 有效抑制了早期、中期和晚期阶段的产物形成
CRediT 作者贡献声明
王硕：写作 - 审查与编辑，写作 - 原稿，研究。 张艳清：写作 - 审查与编辑，监督，资源。 张梦雨：写作 - 审查与编辑，监督。 王敏：写作 - 审查与编辑，监督。 杨坦：写作 - 审查与编辑，监督。 谢俊波：写作 - 审查与编辑，监督，资源。
未引用参考文献
Alexandersson 和 Nestor, 2022
Wu, Hong, Hu, Gong 和 Zhang, 2024
Xing, n.d
竞争利益声明
作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本论文报告的工作。
致谢
这项工作得到了天津市"131"创新型人才培养计划（批准号：201927）的支持。
王硕|张艳清|张梦雨|王敏|杨坦|谢俊波
