通过液-液相分离形成的聚集体作为粘合剂，用于提升基于Fusarium venenatum的肉类仿制品的质量

《Food Hydrocolloids》：Coacervates assembled by liquid-liquid phase separation as binders for improving the quality of Fusarium venenatum-based meat analogues

　　

摘要

Fusarium venenatum固有的纤维结构使其成为制作肉类替代品的理想候选材料。然而，其坚硬的细胞壁结构导致最终产品的质地不佳，这凸显了需要合适的粘合剂来改善质量。在本研究中，7Svicilin与壳聚糖寡糖（COS）以10:1的比例在pH 5.5的条件下形成类液态的共聚物，具有优异的粘弹性和强界面润湿性，适合用于粘合剂设计。相比之下，豌豆蛋白分离物和COS经过液-固相分离（LSPS）后会产生不可逆的沉淀物，缺乏结合性能。而类液态共聚物则依赖于多个结合位点之间的弱多价相互作用，表现为独特的球形液滴形态，从而增强了界面粘附力和结构灵活性。当应用于基于真菌蛋白的肉类替代品时，这种优化后的粘合剂将烹饪损失减少了21.65%，而甲基纤维素基粘合剂的减少比例为29.28%。同时，使用类液态共聚物粘合剂制备的肉类替代品的硬度及咀嚼性显著提升，表明形成了紧密且坚韧的蛋白质网络。总体而言，本研究建立了一种功能性的类液态共聚物系统，为开发高质量肉类替代品提供了一种环保且无人工添加剂的替代方案。

引言

随着全球蛋白质供应压力的增加，Fusarium venenatum已成为一种重要的新型蛋白质来源。从F. venenatum中提取的真菌蛋白（MP）因其纤维状、类似肉的质地、均衡的营养成分以及低碳排放特性而受到广泛关注（He et al., 2024）。然而，F. venenatum坚硬的几丁质-葡聚糖结构限制了其保水性和保油性，导致加工过程中油吸收不足和网络水合作用不充分，从而影响了基于F. venenatum MP的肉类替代品的多汁口感和嫩度。为解决这些问题，通常使用甲基纤维素（MC）和蛋清蛋白作为粘合剂，因为它们具有较好的粘附性能。然而，MC被视为化学合成添加剂，而蛋清含有过敏原，这限制了它们在食品工业中的应用（Hildebrandt et al., 2010）。因此，开发一种既能有效整合产品成分又能提高基于MP的肉类产品保水性和保油性的新型粘合剂变得至关重要。

受贻贝启发，人们在食品系统中发现液-液相分离（LLPS）形成的共聚物具有良好的粘合性能。虽然植物蛋白常被用来构建相分离结构，但由于其内在的聚集性和疏水基团的暴露，它们更容易形成不稳定的液-固相分离（LSPS）沉淀物（X. Yang et al., 2021）。LLPS和LSPS受相似力的驱动，但在特定条件下（包括离子强度、pH值、混合比例、温度和浓度）不同的相互作用强度决定了共聚物和沉淀物的形成和转变（Zheng et al., 2024）。植物蛋白通常具有较低的电荷密度和不均匀的表面电荷分布，这限制了它们与多糖的复杂共聚能力。在这种情况下，高电荷密度的聚电解质由于强烈的静电吸引力而容易发生不可逆的聚集，而低电荷密度的聚电解质则更倾向于形成LLPS共聚物（Muhoza et al., 2022）。复杂的共聚作用很大程度上取决于生物聚合物的化学结构和电荷特性，特别是多糖的电荷密度、蛋白质的电荷各向异性和分布以及生物聚合物的分子量。因此，调节蛋白质构象、pH值和蛋白质与多糖的比例是一种促进蛋白质-多糖系统中LLPS的可行策略。

目前，豌豆蛋白分离物（PPI）因其高营养价值、低成本、温和的豆味和低致敏性而受到关注。然而，由于其固有的结构特性，使用PPI形成复杂共聚物仍然具有挑战性。例如，PPI-糖-甜菜果胶粘合剂可以塑造肉类替代品的形状，但未能提高其保水性和保油性。PPI的主要成分是7S（vicilin）和11S（legumin）组分。先前研究表明，11S组分在豆类蛋白质的自聚过程中起关键作用，而7S组分相比PPI具有更好的溶解性和分散性（Chen et al., 2017; Kornet et al., 2022; Tahir et al., 2024）。因此，7S vicilin与多糖结合时具有形成共聚物的巨大潜力。另一方面，壳聚糖寡糖（COS）作为一种阳离子多糖，因其生物相容性、非过敏性、增强的细胞转导能力和胃肠道吸收性而受到认可（Naveed et al., 2019）。尽管热处理后的COS可以提高大豆蛋白分离物的凝胶性能和粘度，但这一效果与LLPS无关。

因此，本研究旨在使用PPI、7S组分和COS作为天然、健康的功能性材料，通过组成调整开发具有特定粘合特性的植物基粘合剂。通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱（SEC）分析了PPI和7S之间的分子量和结构差异。通过浊度测量系统优化了混合比例和pH值对复杂共聚的影响，以确定粘合剂形成的最佳条件。对所得共聚物的相行为和微观结构进行了表征，并使用等温滴定量热法（ITC）研究了PPI-COS和7S-COS之间的相互作用。最终，将优化后的共聚物作为粘合剂应用于基于MP的肉类替代品中。这些发现有望提供一种天然、无过敏原的合成粘合剂替代品，具有在可持续肉类替代品中的潜在应用。

部分摘录

材料

脱脂豌豆粉来自中国山东的龚白珍食品有限公司（Gong Baizhen Food Co., Ltd.），COS购自中国上海的豫源生物科技有限公司（Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.，CAS RN：148411-57-8）。除非另有说明，所有其他化学品均为分析级。

PPI和7S的制备

PPI的提取采用了略微修改的经典碱法（Q. Zhang et al., 2020）。简而言之，在碱性pH条件下将豌豆粉完全溶解在Milli-Q水中，然后进行离心。

PPI和7S的性质

使用SDS-PAGE（图1A）比较了蛋白质的分子量和亚基组成。PPI在大约100 kDa处显示出与脂氧合酶相关的条带，而7S中没有这种条带。相比之下，7S具有三聚体结构，主要由约150 kDa的亚基组成，包括α、β、γ亚基及其组合（Gravel et al., 2024）。进一步通过SEC（图1B）表征了PPI和7S的分子量分布。

结论

在本研究中，使用7S vicilin和COS在特定条件下（混合比例为10:1，pH 5.5）成功制备了类液态共聚物，其结构与在相同条件下PPI和COS形成的LSPS沉淀物不同。ITC结果显示，类液态共聚物涉及的结合相互作用较弱，但结合位点数量更多，这一结论得到了7S-COS体系观察到更强的荧光强度的支持。

CRediT作者贡献声明

Pengfei Sun：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、软件使用、方法论设计、实验研究、概念构思。Tian Yang：方法论设计、实验研究。Le Zeng：方法论设计、实验研究。Xiao Liu：项目监督、资源协调、资金获取、概念构思。Jianghua Li：项目监督、资源协调。Jian Chen：项目监督、资源协调。Yanan Wang：项目监督、资源协调、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号32502236）、江苏省自然科学基金（编号BK20251618）、江苏省优秀博士后人才资助计划（编号2025ZB007）和江苏省合成生物学基础研究基地（编号BK20233003）的支持。

Pengfei Sun|Tian Yang|Le Zeng|Xiao Liu|Jianghua Li|Jian Chen|Yanan Wang

江南大学未来食品科学中心，中国无锡，214122