不同蛋白质来源的去酰胺蛋白对TG酶介导的大豆蛋白交联作用及热凝胶化过程的影响

《Food Research International》：Protein source-dependent effects of deamidated proteins on TGase-mediated crosslinking and thermal gelation of soy protein

　　• 蛋白质来源的特性调节了TG酶介导的SPI凝胶形成。• 脱酰胺蛋白调节TG酶介导的复合网络形成。• 复合凝胶的G′值提高了10–100倍，凝胶化温度降低了。• 蛋白质特异性相互作用决定了凝胶结构和增强效果。• 凝胶的硬度、弹性及持水能力（WHC）显著改善。

引言
大豆分离蛋白（SPI）是一种高质量的植物源蛋白，因其显著的健康益处、高营养价值、可持续性以及良好的功能特性（如乳化、发泡和溶解性）而受到重视（Qin等人，2016年；Ramachandraiah等人，2017年）。它被广泛用于结构食品中，如肉类替代品、奶油、乳制品替代品以及脂溶性生物活性物质的传递系统（Liang, Chen, Wang等人，2026年；Wang等人，2022年；Zheng等人，2022年）。在其功能特性中，凝胶化行为在形成连续蛋白质网络方面起着核心作用，这强烈影响了质地、持水能力（WHC）和整体产品质量（Zheng等人，2022年）。热诱导大豆蛋白凝胶化是工业食品加工中最常用的方法（Peng等人，2016年）。当加热至75–90°C时，β-CONGLYcinin（7S）和Glycinin（11S）发生部分展开和构象变化，暴露出隐藏的疏水基团、反应性巯基残基和带电的氨基酸侧链（Niu等人，2018年；Renkema等人，2000年）。这些暴露的功能基团通过氢键、疏水相互作用、静电相互作用和二硫键形成促进分子间的关联。在足够高的蛋白质浓度下，蛋白质聚集体的逐步关联和连接最终形成三维凝胶网络，能够固定水分并形成凝胶结构。然而，热诱导的SPI凝胶在质地方面存在局限性，包括相对较低的凝胶强度、较差的弹性和有限的WHC，特别是与动物蛋白基凝胶相比（Liang, Chen, Zhang等人，2024年）。SPI分子的相对紧凑结构和有限的分子灵活性可能限制了有效的分子重排和良好组织的分子连接，导致不均匀的聚集和相对粗糙的凝胶网络（Lee等人，2023年；Utsumi & Kinsella，1985年）。天然SPI凝胶中疏水相互作用、氢键和二硫键等相互作用的紧凑结构和连接性可能不足以形成致密、机械强度高的网络，从而导致相对较弱的、不均匀的凝胶结构（Liang, Chen, Zhang等人，2026年）。因此，改善分子连接性和大豆蛋白凝胶结构仍然是提高SPI凝胶功能的重要研究目标。为了克服这些固有的缺点，已经提出了许多方法来修改SPI结构并增强其凝胶化性能。这些方法包括添加CaSO4和MgCl2等凝固剂、酶处理、超声波和热处理等物理处理，以及与其他食品成分的混合（Jose等人，2016年；Wu, Gao等人，2024年；Yang等人，2023年；Yasir等人，2007年）。最近，转谷氨酰胺酶（TG酶）介导的交联引起了关注，因为TG酶催化蛋白质分子中的谷氨酰胺和赖氨酸残基之间形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸共价交联，从而导致不可逆的蛋白质-蛋白质关联（Liang, Chen, Wang等人，2026年）。TG酶处理可以通过引入共价分子间交联和增强网络连接性来强化蛋白质凝胶网络。然而，仅TG酶介导的SPI分子内的交联并不能完全控制分子组装以实现最佳的凝胶性能，因为反应性谷氨酰胺和赖氨酸残基的可用性有限或受到SPI相对紧凑结构的空间阻碍。因此，单独使用TG酶处理SPI所获得的凝胶增强效果通常是中等的，并且高度依赖于加工条件（Liang, Chen, Zhang等人，2026年）。
一种有效的策略是引入在结构和物理化学性质上不同于SPI的异源蛋白。蛋清蛋白（EWP）、牛血清白蛋白（BSA）、明胶和酪蛋白在分子结构、灵活性、氨基酸组成以及参与非共价或共价相互作用的能力方面有显著差异。将它们掺入SPI系统可能由于额外的分子相互作用位点而在TG酶介导的组装和随后的加热过程中提供互补效应。通过将这些异源蛋白掺入SPI系统中，可以改变分子间力的平衡，包括二硫键结合、氢键结合和共价交联等多种相互作用。这种分子间相互作用的多样化对于构建具有更好机械强度、弹性和WHC的分层凝胶网络至关重要。引入蛋白的性质不仅决定了主要的相互作用类型，还决定了最终的凝胶微观结构和宏观性质。例如，蛋清蛋白（EWP）和牛血清白蛋白（BSA）等蛋白显示出不同的结构特征、氨基酸组成和相互作用偏好。蛋清蛋白含有多个半胱氨酸，可以在热处理过程中参与二硫键介导的相互作用；而具有多个分子内二硫键和活性自由巯基的BSA在某些条件下可以与其他蛋白进行巯基-二硫键交换（Silvester等人，1998年）。明胶作为一种灵活的随机卷曲蛋白，主要通过氢键和链缠结起作用，形成既灵活又保水的网络（Ata等人，2025年）。酪蛋白由于其两亲性和内在的无序结构，增强了疏水相互作用和网络堆积密度，从而提高了凝胶的凝聚力。除了简单的蛋白质物理混合外，酶交联提供了进一步放大混合系统中蛋白质-蛋白质相互作用的强大工具。在混合蛋白系统中，TG酶介导的交联可以促进共价蛋白质组装，并促进不同蛋白质成分整合到复合凝胶基质中。先前的研究表明，TG酶处理可以通过促进分子间交联和蛋白质组装来显著增强基于SPI的复合凝胶的凝胶强度和结构完整性（Liang等人，2025年；Zhang等人，2020年）。然而，蛋白质来源依赖的分子特性如何调节TG酶介导的组装，以及这些分子特性如何随后决定SPI复合凝胶的分子间相互作用、微观结构和宏观性质，目前尚未完全理解。
在混合蛋白系统中的另一个挑战是SPI或异源蛋白可能会自我组装或自我交联，这可能会影响本研究机制的解释。谷氨酰胺酶（PG酶）介导的修饰提供了一种在将其掺入SPI系统之前调整异源蛋白分子特性的方法。使用蛋白谷氨酰胺酶（PG酶）进行选择性脱酰胺可将异源蛋白中的谷氨酰胺残基转化为谷氨酸，同时保留赖氨酸残基，以避免异源蛋白的自组装（Liu等人，2022年）。当脱酰胺后的异源蛋白随后掺入SPI/TG酶系统时，其赖氨酸残基可以参与与SPI中可访问的谷氨酰胺残基的TG酶介导的关联。脱酰胺作为一种预处理，可以调节分子相互作用并引导异源蛋白参与后续的TG酶介导的复合组装。然而，TG酶也可以促进SPI的自交联和与异源蛋白的关联；因此，脱酰胺预期会调节这些组装途径，而不仅仅是选择性地引导一种类型的交联。因此，本研究的目的不是分离或抑制SPI的自组装。本研究将探讨具有不同分子特性的脱酰胺异源蛋白如何影响整体的TG酶介导的组装以及富含SPI的复合凝胶的性能。然而，不同的脱酰胺异源蛋白和TG酶介导的预交联如何调节SPI的凝胶化以及这些分子差异如何转化为凝胶结构和功能仍不清楚。
因此，本研究旨在将具有不同分子特性的脱酰胺异源蛋白（EWP、BSA、明胶或酪蛋白）与SPI结合，并进行TG酶介导的预交联，以比较蛋白质来源对复合组装和热凝胶化的影响。结合TG酶介导的预交联和脱酰胺异源蛋白可能会改变SPI在热凝胶化过程中的分子组装，从而改善凝胶网络。本研究应用了一系列全面的表征技术，包括流变分析、电泳、粒径分布、Zeta电位、红外光谱和共聚焦激光扫描显微镜，以表征凝胶形成和网络特性。因此，本研究确定了不同脱酰胺异源蛋白的分子特性如何影响TG酶介导的SPI组装和随后的热凝胶化，以及分子组装和相互作用的差异如何与凝胶微观结构、机械性质和持水能力（WHC）相关。预期这些发现不仅将深化对混合蛋白凝胶化机制的基本理解，还为开发具有改善质地、稳定性和保水性的先进植物蛋白基结构食品提供实际指导。

材料
大豆（Taiwan 292）从当地超市（中国无锡）购买。蛋清蛋白（EWP）从Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（中国上海）购买。牛血清蛋白（BSA）从Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.（中国上海）购买。明胶（类型B，膨胀度220）从Dongbao Biotechnology Co.（中国内蒙古包头）购买。酪蛋白（CAS）来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）。转谷氨酰胺酶（TG酶，2000 U/mg）由Protein solubility and protein particle size distribution提供。

图1A展示了SPI及其与TG酶处理的SPI/脱酰胺异源蛋白复合系统形成的复合物的溶解度。作为关键指标，蛋白质或蛋白质复合物溶解度的变化反映了SPI-异源蛋白复合物是否形成不溶性聚集体或保持水合状态，从而提供了对后续凝胶形成和功能特性的洞察（Nishinari等人，2014年）。在所有样品中，S4（SPI/CAS-TG）的溶解度显著低于其他样品。

结论
本研究显示，将SPI与脱酰胺蛋白（EWP、BSA、明胶和酪蛋白）混合后进行TG酶交联，有效改善了SPI的热凝胶性能和凝胶效果。与SPI相比，TG酶处理的SPI/脱酰胺异源蛋白表现出依赖于蛋白质的溶解度/分散行为的变化，并且粒径和分子量明显增加，表明形成了更高阶的聚集体和共价网络。GPC/SEC-MALLS确认了这种变化。

作者贡献声明
Guijiang Liang：写作——原始草稿、可视化、调查、正式分析、数据管理。
Wenpu Chen：写作——审稿与编辑。
Siyuan Deng：调查。
Zhaojun Wang：资源获取、资金争取。
Qiuming Chen：资源。
Maomao Zeng：资源。
Zhiyong He：资源。
Douglas Goff：写作——审稿与编辑。
Jie Chen：写作——审稿与编辑、监督、资金争取。

未引用的参考文献
Chen等人，2019

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文所述的工作。

致谢
本研究得到了国家 key 研究与开发计划（中国）的资助，项目编号为2024YFD2100201和2024YFF1106500。

Guijing Liang|Wenpu Chen|Siyuan Deng|Zhaojun Wang|Qiuming Chen|Maomao Zeng|Zhiyong He|Douglas Goff|Jie Chen