《Food Research International》：Harnessing natural deep eutectic solvents Pickering emulsion droplets for biocatalytic production of diacylglycerols via glycerolysis: Elucidating the underlying mechanism of lipase thermostability
编辑推荐：
•开发了一种新型的油包天然深共晶溶剂（O/NADES）乳液平台，用于生产二酰基甘油（DAG）。•在O/NADES和O/甘油Pickering乳液滴中，DAG的生产性能得到了提升。•通过分子动力学模拟，揭示了CALB热稳定性的机理。引言脂肪酶催化的甘油水解是生产二酰基甘油（DAG）
- •
开发了一种新型的油包天然深共晶溶剂（O/NADES）乳液平台，用于生产二酰基甘油（DAG）。
- •
在O/NADES和O/甘油Pickering乳液滴中，DAG的生产性能得到了提升。
- •
通过分子动力学模拟，揭示了CALB热稳定性的机理。
引言
脂肪酶催化的甘油水解是生产二酰基甘油（DAG）和其他结构化脂质的关键途径（Zheng等人，2023年）。然而，油和甘油的不相溶性导致了一个两相系统，反应界面有限，而甘油的高粘度进一步限制了底物的扩散和界面质量传递（Vazquez、Jordan、Reglero和Torres，2016年；Zhou、Lee、Mao、Wang和Zhang，2022年）。由于甘油既作为反应底物又作为极性相，因此必须在不影响酶催化稳定性的前提下提高底物的可用性。因此，人们研究了离子液体、深共晶溶剂、超临界流体和水溶性聚合物等替代介质和添加剂，以调节溶剂微环境并提高酶的活性（Badgujar、Badgujar和Bhanage，2024年；Bekavac等人，2024年；Itoh，2017年；P?tzold等人，2019年）。然而，这些策略主要修改了酶的分子环境，并不能自行生成稳定的油-甘油界面。因此，目前尚不清楚是否可以在富含甘油的条件下，将溶剂介导的酶稳定性和Pickering增强界面质量传递的能力整合到一个单一的甘油水解平台中。因此，需要一个结合了以甘油为基础的极性介质和颗粒稳定界面的生物催化系统。
由固体颗粒稳定的Pickering乳液在生物催化领域引起了广泛关注（Yin等人，2024年）。在油-水界面形成的颗粒层增强了抗聚合作用并保持了结构完整性，从而创造了稳定且可控的反应微环境（Sun和Wu，2024年）。这种配置有利于提高有效的界面面积、酶-底物相互作用频率以及界面质量传递效率（Huang等人，2020年）。
在Pickering乳液中进行的系列脂肪酶催化反应，如酯化（Sun等人，2025年）、 transesterification（Wang等人，2018年）和水解（Lin等人，2025年），显示出比传统两相系统更高的反应速率、产物选择性和酶的重用性。这些乳液的界面结构有助于保持脂肪酶的开放活性构象，并减轻了热或剪切引起的干扰，从而提高了酶的长期操作稳定性（Sun、Dong、Wang、Huang和Zheng，2020年；Yin、Zhang和Mao，2023年）。
尽管Pickering乳液系统具有许多优势，但其整体稳定性受到溶剂环境的显著影响。溶剂的物理化学性质，包括极性、粘度、介电常数和氢键供体-受体能力，直接影响固体颗粒在油-水界面的吸附强度、它们的堆积密度以及界面的机械性质。因此，开发既能稳定酶又能提高底物可用性的绿色介质至关重要。天然深共晶溶剂（NADES）作为一类新兴的生物相容性溶剂，满足这些要求（Huang等人，2026年）。它们可调的极性和粘度，加上调节氢键网络的能力，有助于保持酶的构象。由氯化胆碱（ChCl）和甘油（Gly）组成的NADES被用作提高脂肪酶热稳定性和操作稳定性的环保溶剂（Nian、Cao和Liu，2019年；Tan和Dou，2020年）。由于它们在酯化（Ankaya、Unlu和Takac，2019年）、 transesterification（Noro等人，2023年）和水解反应（Juneidi、Hayyan、Hashim和Hayyan，2016年）中对底物溶解度和产物选择性的卓越能力，这些过程在复杂的脂质生物转化中具有重要的实际价值（Xu、Zheng、Zong、Li和Lou，2017年）。
基于Pickering乳液和NADES的协同优势，我们的团队之前开发了一种油包NADES的Pickering界面生物催化（PIB）系统，使用以甘油为基础的NADES作为连续相（Pan等人，2025年）。这一创新平台促进了高酸性油脂脱酸的高效酶促酯化过程，在脱酸速率、三酰基甘油（TAG）保留率和酶可回收性方面优于传统两相系统。然而，那项研究针对的是游离脂肪酸（FFA）的酯化，此时需要保留TAG。在本研究中，反应目标进行了反向调整，有意促进TAG的水解以生产DAG。由于甘油既作为反应物，又作为极性相的主要成分或整个极性相，同时改变其比例会改变底物的可用性和反应介质的流变和界面性质。之前建立的PIB概念在这种底物-相耦合条件下是否仍然有效尚不明确。
本研究的目的是开发并评估一种Pickering界面甘油水解平台，该平台结合了溶剂介导的CALB稳定性调节和Pickering增强的界面质量传递，以生产DAG产品。由于甘油既作为底物又是极性相的主要成分，因此假设富含甘油的NADES可以提高底物的可用性，同时保持有利于CALB的溶剂环境。为了验证这一假设，系统地改变了极性相的组成，并选择了纯甘油作为进一步分析的候选方案；随后基于筛选结果选择了ChCl/Gly（1:8）配方。在不同的油源和NADES摩尔比下评估了滴体结构、粘度和催化性能。通过动力学和热力学分析，并结合分子动力学模拟，阐明了溶剂对酶行为的影响。研究结果展示了基于甘油的NADES Pickering系统在甘油水解方面的可行性和优势，并为设计绿色溶剂和脂质生物催化中的界面工程提供了机制见解。
章节片段
材料
来自诺维信（北京，中国）的Candida antarctica脂肪酶B（CALB）。SiO?纳米颗粒（CAS编号7631-86-9）、氯化胆碱（CAS编号67–48-1）、甲苯（CAS编号108–88-3）、正己烷（CAS编号110–54-3，HPLC等级）、异丙醇（CAS编号67–63-0，HPLC等级）、磷酸二氢钠（CAS编号7558-79-4）、磷酸二氢钾（CAS编号7778-77-0）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（CAS编号919–30-2）、甲酸（CAS编号64–18-6，HPLC等级）和无水乙醇（CAS编号……）。
Pickering乳液的表征
制备的CALB@SiO?-APTES的蛋白质负载量为122 mg g?1。CALB@SiO?-APTES和游离CALB的水解活性分别约为17.02 U g?1和13.51 U g?1，相应的活性回收率为126.0%。通过测量三相接触角并计算油/NADES界面处的颗粒吸附能量来评估CALB@SiO?-APTES稳定乳液的界面性质。这两个指标通常用于评估颗粒...
结论
建立了一个用于脂肪酶催化甘油水解的Pickering界面生物催化平台，实现了TAG向DAG的转化。在此设计中，甘油同时作为反应底物和极性相本身或极性相的主要成分，极性相可以是纯甘油或氯化胆碱/甘油NADES。在乳化过程中形成了分散的油-极性相界面，并通过CALB@SiO?-APTES颗粒进行稳定，从而...
CRediT作者贡献声明
刘伟琦：撰写——初稿，可视化，数据管理。刘冲：撰写——初稿，资源准备。程爽：撰写——初稿，可视化，软件，形式分析。赵志豪：验证。邓园媛：项目管理。刘光：方法学。赵泽新：验证，监督，软件，资源，方法学。周鹏飞：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，监督，资金获取。张明伟：监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者非常感谢来自中国国家重点研发计划（编号2024YFD2101501）、广东省基础与应用基础研究基金会（编号2025A1515010530）、广东省科学技术局（编号2025B0202130004）、高级农业科学院科技创新战略建设专项基金（编号R2023PY-JX018）以及现代创新研究团队建设项目的财政支持。
Weiqi Liu|Chong Liu|Shuang Cheng|Zhihao Zhao|Yuanyuan Deng|Guang Liu|Zexin Zhao|Pengfei Zhou|Mingwei Zhang
