碳水化合物利用调控因子Cbr1在担子菌酵母中协调营养特异性基因激活与选择性碳分解代谢物阻抑

《PLOS Biology》：The carbohydrate utilization regulator Cbr1 coordinates nutrient-specific gene activation with selective carbon catabolite repression in a basidiomycete yeast

　　

细胞必须感知并响应营养才能存活。为了在混合碳环境中高效生长，当存在更简单的碳源（如葡萄糖）时，微生物会抑制那些利用需要大量资源分解代谢的碳源所必需的基因。这一过程称为碳分解代谢物阻抑（carbon catabolite repression, CCR）。在真菌中，典型的营养感知转录网络由碳源特异性转录因子和碳分解代谢物阻抑调控因子组成，前者激活碳源利用基因，后者在存在偏好碳水化合物时广泛抑制所有非偏好碳源利用基因。与该模型相反，研究人员在担子菌酵母红冬孢酵母（Rhodotorula (Rhodosporidium) toruloides）中鉴定到一个转录因子（Cbr1），它特异性抑制葡萄糖介导的二糖和脯氨酸利用阻抑，提出了一种定制化碳分解代谢物阻抑调控机制，用以对抗二糖利用过程中释放葡萄糖所形成的负反馈回路。Cbr1也是纤维二糖、龙胆二糖、羧酸和岩藻糖利用所必需的。通过转录组学和分子分析，研究人员证明了这些碳源的分解代谢没有代谢关联，但其利用所需基因由Cbr1响应每种碳源而共同激活。这种共激活表明R. toruloides可能同时遇到这些碳源，可能发生在自然界微生物之间的复杂相互作用中。一个转录因子对营养特异性基因激活和碳分解代谢物阻抑的协同调控，建立了真菌中构建营养感知转录网络的一种此前未被表征的机制。表征多样的营养感知调控机制，对于理解真菌致病过程中的资源获取（其中碳分解代谢物阻抑对毒力和药物耐受至关重要）以及用于绿色生物技术的真菌代谢工程至关重要。

碳水化合物利用调控因子Cbr1在担子菌酵母中协调营养特异性基因激活与选择性碳分解代谢物阻抑——论文解读

该论文发表于《PLOS Biology》。研究背景方面，真菌必须感知并响应环境中的营养物质才能生存和竞争。已有关于碳源利用调控的研究主要集中于子囊菌门，其调控网络由碳源特异性转录因子激活相应利用基因，并由碳分解代谢物阻抑（carbon catabolite repression, CCR）调控因子在偏好碳源存在时广谱抑制非偏好碳源基因。然而，担子菌门与子囊菌门分化约4亿年，占描述真菌物种的30%以上，其中包含许多重要病原菌，但其碳利用调控机制研究严重不足。红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides，曾用名Rhodosporidium toruloides）是一种担子菌酵母，能利用大多数植物生物质可溶性降解产物，并可在特定条件下积累高达70%的脂肪酸，产生类胡萝卜素等次生代谢物，既是新兴机会致病菌（常具有抗真菌药物耐药性），也是代谢工程的重要宿主。因此，解析其碳利用调控机制对理解真菌致病性、药物耐受以及绿色生物技术应用具有重要意义。

研究人员通过同源搜索在R. toruloides基因组中鉴定到一个CLR-2/ClrB同源基因RTO4_13588，命名为CBR1（cellobiose regulator 1）。功能实验表明，CBR1缺失导致细胞完全丧失在纤维二糖、龙胆二糖、三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环中间体（柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸）和岩藻糖上的生长能力，而外源表达CBR1可恢复生长。粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的clr-2缺失突变体在这些碳源上无生长缺陷，表明Cbr1在R. toruloides中的功能相对于子囊菌直系同源物显著扩展。转录组分析显示，Cbr1直接或间接调控一个核心调控子，包含五个基因：两个预测β-葡萄糖苷酶基因（RTO4_16716和RTO4_16717）、两个预测主要协助扩散超家族（major facilitator superfamily, MFS）转运蛋白基因（RTO4_10339和RTO4_13825）和一个预测磷酸甘油酸变位酶基因（RTO4_11229）。功能研究证明，RTO4_16717（BGL1）编码主要的分泌型β-葡萄糖苷酶，是纤维二糖和龙胆二糖利用所必需；RTO4_16716（BGL2）也贡献β-葡萄糖苷酶活性。Bgl1/Bgl2切割β-1,4和β-1,6葡萄糖-葡萄糖糖苷键。RTO4_13825（TCT1）编码柠檬酸转运蛋白，定位于质膜，是柠檬酸摄取所必需。Cbr1调控的β-葡萄糖苷酶基因是纤维二糖和龙胆二糖利用的唯一Cbr1调控必需因子，因为组成型表达BGL1可恢复cbr1Δ细胞在纤维二糖上的生长，外源添加含β-葡萄糖苷酶的上清液也能回补生长。进一步研究表明，CBR1介导的纤维二糖转录响应依赖于分泌型β-葡萄糖苷酶，bgl1Δbgl2Δ细胞的转录谱与cbr1Δ相似；低浓度（1 μM）2-脱氧葡萄糖可诱导BGL1表达，表明激活信号是纤维二糖分解产生的低浓度葡萄糖而非纤维二糖本身。Cbr1还直接或间接抑制碳分解代谢物阻抑，且具有选择性。在麦芽糖、海藻糖或脯氨酸作为非偏好碳源时，cbr1Δ细胞对2-脱氧葡萄糖的敏感性显著高于野生型，相关利用基因（AGL1、预测脯氨酸脱氢酶基因RTO4_14602）的表达在2-脱氧葡萄糖存在下在cbr1Δ中下降更多；但在木糖、Tween-80或醇利用方面，cbr1Δ与野生型无差异。N. crassa的CLR-2没有类似功能，说明这是Cbr1在担子菌中扩展的功能。

关键技术方法方面，研究人员主要使用了：同源搜索与系统发育分析鉴定候选转录因子；农杆菌介导转化构建基因缺失、互补、荧光标签和组成型表达菌株；利用标准RNA测序（RNAseq）和3′RNAseq（QuantSeq）进行转录组分析，并用DESeq2鉴定差异表达基因；采用RT-qPCR验证关键基因表达；利用荧光显微镜观察Cbr1-GFP和Tct1-mRuby的亚细胞定位；通过p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside比色法和葡萄糖释放实验测定分泌β-葡萄糖苷酶活性；利用柠檬酸比色法测定柠檬酸摄取；通过生长曲线和2-脱氧葡萄糖敏感性实验评估碳分解代谢物阻抑。菌株来源包括R. toruloides IFO 0880（NBRC 0880，日本NITE生物资源中心）和N. crassa FGSC 2489（真菌遗传学库存中心）。

研究结果分述如下。

（一）Cbr1是纤维二糖、龙胆二糖、TCA循环中间体和岩藻糖利用所必需的。通过同源搜索鉴定到RTO4_13588，基因缺失和互补生长实验证实cbr1Δ不能利用这些碳源，且该功能相对N. crassa CLR-2为扩展功能。

（二）Cbr1直接或间接激活响应纤维二糖、TCA循环中间体和岩藻糖的核心调控子五个基因。通过转录组测序和功能富集分析，鉴定出五个核心基因，包括β-葡萄糖苷酶基因、MFS转运蛋白基因和磷酸甘油酸变位酶基因。

（三）Cbr1调控的β-葡萄糖苷酶是纤维二糖和龙胆二糖利用所必需的。基因删除和酶活实验证明BGL1和BGL2编码分泌型β-葡萄糖苷酶，负责细胞外切割二糖。

（四）CBR1介导的纤维二糖转录响应依赖于细胞外β-葡萄糖苷酶。通过比较bgl1Δbgl2Δ与cbr1Δ转录谱，以及低浓度2-脱氧葡萄糖诱导实验，表明激活信号是葡萄糖。

（五）Cbr1调控的转运蛋白基因是柠檬酸利用所必需的。TCT1编码质膜柠檬酸转运蛋白，tct1Δ不能摄取柠檬酸，Tct1定位受碳源调控。

（六）Cbr1直接或间接抑制二糖和脯氨酸利用过程中的碳分解代谢物阻抑。通过2-脱氧葡萄糖敏感性实验和基因表达分析，证明Cbr1选择性抑制特定非偏好碳源利用基因的阻抑。

讨论部分指出，Cbr1对纤维二糖、龙胆二糖、TCA循环中间体和岩藻糖利用的共调控可能反映R. toruloides在自然界中会同时遇到这些碳源，例如在真菌共同降解植物生物质的环境中。Cbr1同时调控营养特异性基因激活和选择性碳分解代谢物阻抑，打破了已知真菌碳利用调控网络由两类独立调控因子组成的范式。这种选择性CCR调控可能允许细胞在二糖降解产生葡萄糖时仍持续表达水解酶，从而避免负反馈循环。该研究扩展了对担子菌中碳代谢调控多样性的认识。研究结论：Cbr1是担子菌酵母R. toruloides中一个多功能的碳利用调控因子，它直接或间接激活纤维二糖、龙胆二糖、TCA循环中间体和岩藻糖利用基因，并特异性抑制二糖和脯氨酸利用基因的碳分解代谢物阻抑，这种由一个转录因子协调激活与去阻抑的机制为真菌营养感知转录网络提供了新的范式。理解这些机制对于防治真菌病害、优化抗真菌药物疗效以及代谢工程改造真菌用于绿色生物技术具有重要意义。