《PLOS Genetics》：Multi-organ single-cell transcriptomic atlas identifies QrIAA14 as a candidate negative regulator of adventitious root development in Quercus robur
编辑推荐：
植物器官发育涉及多个组织中协调的细胞命运转变，然而木本植物中器官特异性分化所依赖的细胞程序仍知之甚少，尤其是限制栎属（*Quercus*）物种营养繁殖过程中有效根系发育的机制。在本研究中，研究人员构建了夏栎（*Quercus robur*）叶片、茎和根组织的全
植物器官发育涉及多个组织中协调的细胞命运转变，然而木本植物中器官特异性分化所依赖的细胞程序仍知之甚少，尤其是限制栎属（*Quercus*）物种营养繁殖过程中有效根系发育的机制。在本研究中，研究人员构建了夏栎（*Quercus robur*）叶片、茎和根组织的全面单细胞转录组景观，以在细胞分辨率下解析发育轨迹。共有41,471个高质量细胞被分类为30个不同的细胞簇，从而能够在三个营养器官中鉴定主要细胞类型和器官特异性转录特征。拟时（pseudotime）分析揭示了与叶片保卫细胞分化、茎维管形成和根组织发育相关的发育程序。此外，研究人员结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、批量转录组分析和植物激素研究，鉴定出生长素信号是不定根发育过程中的重要调控因子。值得注意的是，IAA14同源物QrIAA14-1在根发育轨迹中优先富集于根毛、近根毛细胞和根冠，这一结果得到了实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和原位杂交实验的进一步支持。此外，QrIAA14-1的过表达显著抑制了栎树根系伸长，与对照植株相比，不定根长度减少了约64.46%，为栎树根系发育受限提供了机制性见解。综上所述，本研究提供了首个栎属营养器官细胞组织和发育动力学的高分辨率单细胞图谱，并鉴定了与根系发育相关的候选调控基因，为木本植物根系再生和克隆繁殖的调控机制提供了新见解。
**多器官单细胞转录组图谱揭示QrIAA14负调控夏栎不定根发育的机制**
**一、研究背景与科学问题**
栎属（*Quercus* L.）是壳斗科（Fagaceae）中最大的属，包含约400–500个物种，是北半球温带森林的关键树种。夏栎（*Quercus robur*）作为欧洲分布最广、最具文化和生态意义的栎树物种，其木材坚硬、纹理美观，长期被用于造船、地板、酒桶和家具制造。然而，夏栎因生根能力差而极难进行营养繁殖，严重阻碍了优良基因型的快速保存和大规模利用。因此，鉴定控制根系形成的关键遗传调控因子，对于制定有效的克隆繁殖策略至关重要。生长素信号通路已被广泛认为是不定根发生、原基形成及随后伸长过程的核心调控通路。在该通路中，AUX/IAA（Auxin/Indole-3-Acetic Acid）转录抑制因子作为核心负调控因子发挥关键作用。此前研究已报道了多个AUX/IAA成员在不同植物中调控根系发育的功能，但在栎属中，生长素介导的不定根形成的细胞和分子基础仍不清楚。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术已在拟南芥、水稻、杨树、桉树等多种植物中成功应用，但栎属的单细胞测序研究尚未见报道，这限制了与不定根形成相关的关键基因鉴定和功能探索。为此，研究人员开展了本研究。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员构建了涵盖夏栎叶片、茎和根组织的综合单细胞转录组图谱，共获得41,471个高质量细胞并划分为30个细胞簇，在细胞分辨率下解析了三个营养器官的细胞类型组成和器官特异性转录特征。通过整合scRNA-seq、批量转录组测序（bulk RNA-seq）、植物激素定量分析、RT-qPCR、RNA原位杂交和转基因过表达实验，鉴定出生长素信号是夏栎不定根发育的关键调控因子，并证实QrIAA14-1（IAA14同源物）作为候选负调控因子抑制不定根伸长。该研究提供了首个栎属营养器官的高分辨率单细胞图谱，为木本植物根系再生和克隆繁殖的调控机制提供了新见解。论文发表在《PLOS Genetics》。
**三、主要技术方法**
本研究采用的主要关键技术方法包括：10x Genomics平台scRNA-seq文库构建与Seurat聚类分析；Monocle2拟时轨迹分析；Illumina平台的bulk RNA-seq；高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）植物激素定量检测；RT-qPCR和RNA原位杂交；农杆菌介导的遗传转化过表达实验。样本来源于新疆乌鲁木齐市新市区林苑林场采集的夏栎种子建立的组培无性系，scRNA-seq取材于4周龄组培苗的叶片、茎和根，bulk RNA-seq取材于不定根发育R1、R2、R3和R5阶段的愈伤组织和/或不定根组织。
**四、研究结果**
**1. 夏栎单细胞转录组图谱的构建**
研究人员从叶片、茎和根组织中分离原生质体，经严格质控后共获得41,471个高质量单细胞，通过UMAP降维聚类分为30个细胞簇（簇0至簇29）。叶片来源细胞主要分布于簇2、簇25和簇27，KEGG富集显示其参与光合作用和蛋白质生物合成通路。茎来源细胞主要分布于8个细胞簇，涉及蛋白质加工、信号转导和氧化磷酸化通路。根来源细胞分布最广，其中簇17、19、20、23和26为根特异细胞簇，主要与糖酵解/糖异生、氧化磷酸化、柠檬酸循环、苯丙烷生物合成和单萜生物合成通路相关。
**2. 叶片细胞类型鉴定与分化轨迹**
基于标记基因，叶片中共鉴定出表皮、保卫细胞、叶肉细胞、叶肉前体细胞、木质部、韧皮部和原形成层7种主要细胞类型。拟时分析重建了从表皮细胞向保卫细胞分化的连续过程。沿该轨迹，表皮细胞分布于早期拟时阶段，保卫细胞在后期积累。表皮和保卫细胞相关基因分为4个转录簇（C1–C4），其中C1簇基因在保卫细胞中显著上调，富集于糖酵解/糖异生、光合碳固定和角质、木栓质及蜡质生物合成通路，代表性基因包括EPF2（EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2）、CNGC15（Cyclic Nucleotide-Gated Channel 15）、ABCG11（ATP-Binding Cassette G11）和GPAT6（Glycerol-3-Phosphate Acyltransferase 6）。
**3. 茎组织细胞类型鉴定与分化轨迹**
茎组织中共鉴定出形成层、木质部、木质部薄壁细胞、纤维细胞、韧皮部、筛管、表皮和光合作用相关细胞等细胞类群。UMAP分析显示形成层细胞在转录上邻近多种维管细胞类型。拟时分析重建了木质部、木质部薄壁细胞和纤维细胞的分化分支，三者表现出不同的转录重编程。木质部分支基因富集于次生代谢和信号通路；木质部薄壁细胞富集于蛋白质周转和植物激素信号转导通路；纤维细胞分支则显著富集能量代谢、次生代谢和细胞壁生物合成通路，代表性差异表达基因包括PAL2（Phenylalanine Ammonia-Lyase 2）、C4H（Cinnamate 4-Hydroxylase）、CAD9（Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase 9）和过氧化物酶（PER）基因。
**4. 根组织细胞类型鉴定与分化轨迹**
根组织中鉴定出表皮、根毛细胞、近根毛细胞、皮层、内皮层、木质部、韧皮部和根冠细胞。拟时轨迹分析重建了表皮→近根毛→成熟根毛的分化连续过程。根冠细胞的拟时分析显示从簇26向簇19的方向性进程。根冠和近根毛细胞的差异表达基因显著富集于植物激素信号转导通路，其中生长素信号组分占比最大（12个基因），其次为ABA（7个）、细胞分裂素（5个）和水杨酸（5个）信号通路。AUX/IAA家族成员Qr03G000896（IAA4-1）、Qr06G000865（IAA14-1）和Qr06G001804（IAA9-1）在根冠、近根毛和根毛细胞中显著上调。
**5. 根发育观察与bulk RNA-seq分析**
夏栎不定根发育在组织培养繁殖过程中可分为R0–R5六个阶段。对R1、R2、R3和R5阶段取样进行转录组测序，共鉴定出12,175个非冗余差异表达基因（DEGs），显著富集于植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢及苯丙烷生物合成通路。91个DEGs与激素信号转导相关，其中41个（43.15%）与生长素信号相关。64个DEGs富集于淀粉和蔗糖代谢通路，表明碳水化合物在不定根发育中发挥能量供给作用。
**6. 根发育过程中的植物激素变化**
HPLC-MS/MS定量分析显示，吲哚-3-乙酸（IAA）含量在根分化过程中显著增加，R5阶段约为R1的2.2倍；反式玉米素（tZ）在R3阶段升高至R1的4–5倍；而反式玉米素核苷（tZR）、脱落酸（ABA）、赤霉素A4（GA4）和乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）则表现出下调模式。
**7. QrIAA14-1过表达抑制不定根伸长**
在六个比较组的TOP30转录调控因子中，Qr06G000865（QrIAA14-1）、Qr12G002242（QrIAA14-2）、Qr03G000725（QrIAA16）、Qr05G000791（QrIAA26）和Qr05G000869（QrIAA27）一致表现出显著差异表达。共表达网络分析显示QrIAA14-1与7个QrARF成员具有相似的表达模式，其中QrARF8-1在表皮至根毛发育轨迹中显著表达。单细胞水平分析表明QrIAA14-1和QrIAA14-2在根细胞簇中优势表达，并在根毛和近根毛细胞中优先富集。RT-qPCR证实QrIAA14-1在R3阶段表达量较R1升高100倍以上。RNA原位杂交显示QrIAA14-1在R2阶段根原基相关组织和R5阶段根冠区域优势表达。过表达QrIAA14-1的转基因株系不定根长度较35S:GFP对照减少约64.46%（p＜0.001），证实QrIAA14-1负调控不定根伸长。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，本研究通过统一的单细胞分析框架同时解析多个营养器官，为栎属营养器官发育的机制研究提供了宝贵资源。针对木本植物原生质体制备中次生壁加厚和木质化带来的技术挑战，本研究通过优化的原生质体分离策略成功捕获了具有转录信息量的细胞群体，并整合bulk RNA-seq、激素谱、RT-qPCR、原位杂交和转基因验证等多维度证据，增强了细胞类型注释和候选基因鉴定的可靠性。研究还提出，生长素水平与AUX/IAA介导的抑制反馈可能共同构成调控不定根发生和伸长的调控网络，QrARF8-1被确定为一个潜在的优先ARF候选因子。未来可结合空间转录组学、功能缺失分析和蛋白互作实验进一步阐明调控机制。
研究结论表明，本研究提供了夏栎主要营养器官的首个系统性单细胞转录组图谱，共鉴定出30个细胞簇，解析了保卫细胞分化、维管形成和根发育的器官特异性转录程序和分化轨迹。通过整合scRNA-seq与bulk RNA-seq、植物激素分析、RNA原位杂交、RT-qPCR和转基因实验，证实生长素信号是栎树根系发育的关键调控因子。QrIAA14-1的过表达显著抑制不定根伸长，为栎属物种根系发育受限提供了机制性见解。该研究不仅提供了大量细胞特异性标记基因，也为在单细胞分辨率下研究栎属物种营养发育的基本原理丰富了宝贵资源。
