使用Nanopore直接RNA测序表征人类转录组中METTL3/14介导的m6A修饰

《PLOS Genetics》：Characterization of METTL3/14-mediated m6A modification in human transcriptome using Nanopore direct RNA sequencing

　　

转录后RNA修饰调节RNA代谢的多个方面。N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是最丰富的内部RNA修饰之一，由核心甲基转移酶复合物METTL3和METTL14沉积。牛津纳米孔技术（ONT）平台允许对天然RNA分子进行直接、单分子测序，同时保留天然修饰。然而，若无严格的基准测试，修饰检测的准确性和可重复性仍不确定。在此，研究人员利用ONT，通过整合两种直接RNA测序化学试剂（RNA002和RNA004）与m6Anet和Dorado修饰检测模型，以单核苷酸分辨率全面表征细胞RNA中的真实m⁶A修饰。研究人员在人类细胞中独立敲低METTL3和METTL14，并通过多种检测方法和独立的正交方法（GLORI和miCLIP）严格验证了修饰调用。研究人员发现Dorado检测到更多数量的m⁶A事件，并能够同时检测其他RNA修饰（5-甲基胞嘧啶（m⁵C）、假尿苷（Ψ）和肌苷）。将Dorado与体外转录（IVT）未修饰对照在严格过滤下配对使用，研究人员提供了有力证据支持在编码序列和基因范围内，特别是在高修饰基因和位点以及共识DRACH基序中，m⁶A位点和化学计量发生全局性减少。研究人员报告了修饰转录本的差异性和复杂性调控，伴随poly(A)尾长度的全局性减少。值得注意的是，METTL3和METTL14的敲低产生了不同的转录本特异性效应，支持它们在m⁶A写入复合物中的非冗余作用。总之，该研究展示了ONT能力的显著进步，并建立了用于RNA修饰检测的稳健转录组范围框架，从而为探索METTL3/METTL14对细胞功能和疾病的贡献奠定了基础。

**论文解读：利用Nanopore直接RNA测序表征METTL3/14介导的m⁶A修饰**

信使RNA（mRNA）携带多种化学修饰，这些修饰调节其剪接、出核、定位、翻译和降解等生命周期环节。N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是其核mRNA中最普遍的内部修饰，由METTL3/METTL14异二聚体核心复合物催化沉积，影响分化、胚胎发育和应激反应等生理过程。传统基于二代测序（NGS）的m⁶A检测方法，如抗体依赖的MeRIP-Seq和miCLIP，或抗体非依赖的MAZTER-Seq和DART-Seq，存在抗体非特异性结合导致的高假阳性率、修饰化学计量估计不准、分辨率不足以精确定位修饰位点、且受限于特定序列背景等缺陷。短读长测序通常只能在基因水平聚合分析，无法检测单RNA分子水平的事件，也限制了对RNA修饰与RNA特征直接关联的研究。牛津纳米孔技术（ONT）可直接对天然RNA分子进行长读长测序，保留m⁶A等修饰及poly(A)尾，但修饰检测的准确性和可重复性尚缺乏严格基准测试。

本研究利用ONT直接RNA测序（dRNA-Seq），结合RNA002和RNA004两种化学试剂以及m6Anet和Dorado两种修饰检测模型，在METTL3或METTL14敲低（KD）的HeLa细胞中全面分析m⁶A修饰。研究人员通过siRNA分别敲低METTL3和METTL14，用Western blot、qPCR、SELECT和m⁶A dot blot验证了敲低效率和m⁶A水平变化。结果显示，敲低后已知m⁶A底物MYC蛋白显著下降，特定位点m⁶A水平降低，全局m⁶A丰度约减少50%。利用IVT未修饰对照进行假阳性校正后，研究发现METTL3/14敲低导致m⁶A位点总数和化学计量在编码序列和基因范围内全局减少，尤其在DRACH基序和高修饰基因中；同时poly(A)尾长度出现全局缩短。METTL3和METTL14敲低产生不同的转录本特异性效应，支持两者在m⁶A写入复合物中的非冗余作用。该研究发表于《PLOS Genetics》，建立了转录组范围的RNA修饰检测框架，为理解METTL3/14在细胞功能和疾病中的作用奠定了基础。

**主要关键技术方法**：样本为HeLa细胞（ATCC来源）。采用TERA-Seq方法构建ONT dRNA-Seq文库，分别使用RNA002和RNA004化学试剂在MinION/PromethION平台测序。使用m6Anet和Dorado模型进行修饰调用，并用体外转录（IVT）未修饰对照建立9-mer假阳性参考表进行校正。通过siRNA敲低METTL3/14，结合Western blot、qPCR、SELECT和m⁶A dot blot验证。与公开的GLORI和miCLIP数据集对比。poly(A)尾长度用Nanopolish估计。所有分析基于GRCh38参考基因组，使用minimap2比对，Modkit计算修饰占比。

**研究结果**：

**METTL3/14敲低细胞中HeLa转录组的Nanopore dRNA-Seq**：研究人员使用RNA002和RNA004化学试剂对对照（CTRL）、METTL3 KD和METTL14 KD细胞进行测序，分别获得约660万和1.01亿条reads，重复间相关性高。Western blot和qPCR确认敲低效率约75-90%，SELECT实验证实H1-0和MALAT1上特定m⁶A位点修饰减少，dot blot显示全局m⁶A水平下降。

**使用m6Anet和Dorado模型进行全基因组m6A检测及假阳性校正**：m6Anet和Dorado均能调用m⁶A位点，但Dorado调用位点数远多于m6Anet。通过IVT对照校正后，CTRL中去除3,890个假阳性位点。METTL3/14敲低后总m⁶A位点数减少，且经downsampling验证稳健。两模型间重叠有限，但大部分m6Anet位点包含在Dorado调用中。

**对照和METTL3/14敲低细胞中DRACH基序的m6A修饰分布**：m⁶A位点富集于CDS末端和3' UTR，与miCLIP一致，与GLORI有44%重叠。在DRACH和GGACU基序中，敲低后m⁶A修饰水平显著降低，而非DRACH位点无变化。高修饰基因的修饰频率下降最明显，GGACU基序中METTL14 KD降低更显著。

**m6A与其他RNA修饰的共现**：Dorado可同时检测m⁶A、m⁵C、Ψ和肌苷。基因水平分析显示，METTL3/14敲低后，肌苷与m⁶A的共现概率略有降低，其他修饰无显著变化。

**m6A甲基化及其与mRNA丰度和poly(A)尾长度的相关性**：通过qPCR验证15个基因，发现METTL3和METTL14敲低导致不同的表达变化，METTL14 KD更多引起上调。poly(A)尾长度在敲低后显著缩短（中位数从112 nt降至106 nt和96 nt），且高m⁶A修饰的转录本倾向有更长的poly(A)尾。基因分类分析显示METTL3和METTL14敲低影响重叠但不同的基因集，富集于DNA代谢、线粒体等GO项。

**讨论与结论**：讨论部分指出，本研究首次联合分析METTL3和METTL14介导的m⁶A修饰，通过多种正交方法验证了ONT检测的可靠性。尽管存在poly(A)选择偏倚等局限，但严格过滤和验证使结果稳健。METTL3和METTL14在m⁶A沉积中具有非冗余功能，可能通过不同机制调控转录本命运。m⁶A与poly(A)尾长度密切相关，敲低导致poly(A)尾缩短，但不同转录本反应异质。结论：该研究展示了ONT能力的显著进步，建立了转录组范围RNA修饰检测框架，为探索METTL3/METTL14在细胞功能和疾病中的作用奠定了基础。