GH29 α-L-岩藻糖苷酶 PsaFuc 受体特异性调控的结构基础

《International Journal of Biological Macromolecules》：Structural basis for acceptor specificity modulation in GH29 α-L-fucosidase PsaFuc

　　

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  PsaFuc 在转糖基化中显示出供体依赖的受体特异性。
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  C 结构域有助于 PsaFuc 对供体和受体的识别。
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  对 L-岩藻糖和 D-半乳糖的不同亲和力改变了 C 结构域的构象。
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  R505 在 C 结构域内的差异定位调节受体特异性。
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  R505A 拓宽了转糖基化反应的受体谱。

引言

岩藻糖基化寡糖是许多生物活性聚糖和糖缀合物的关键结构成分，并在各种生物过程中发挥重要作用 [1], [2], [3]。例如，在人乳寡糖 (HMOs) 中，L-岩藻糖 (L-Fuc) 通过 α-1,2/3/4/6 糖苷键连接到不同的糖基部分。这些岩藻糖基化寡糖参与肠道菌群调节、病原体防御、免疫系统成熟和神经发育 [4], [5], [6], [7], [8]。因此，合成结构多样化的岩藻糖基化寡糖对于开发功能食品和基于碳水化合物的治疗方法具有很高的价值。

岩藻糖基化寡糖可以通过化学或酶法合成。化学合成通常涉及复杂的保护和脱保护步骤，并受到区域选择性低、产率低和成本高等限制，这限制了其实际适用性 [9], [10]。相比之下，酶法合成具有高区域选择性、反应条件温和和环境友好等优点，从而克服了化学途径的主要限制。它主要包括基于糖基转移酶和基于糖苷水解酶的方法。糖基转移酶通常需要昂贵的核苷酸激活的糖供体，而糖苷水解酶由于其可获得性、广泛的底物耐受性、能够使用低成本底物以及易于生产和纯化而更具吸引力 [11], [12]。其中，α-L-岩藻糖苷酶可以从聚糖的非还原端水解 α-L-岩藻糖基部分。此外，在适当的反应条件下，这些酶还能够通过转糖基化反应将岩藻糖基部分从供体转移到受体，从而产生岩藻糖基化寡糖 [13], [14], [15]。α-L-岩藻糖苷酶主要归类于糖苷水解酶 (GH) 家族 29 和 95 [16], [17]。GH29 α-L-岩藻糖苷酶特别适合用于转糖基化介导的寡糖合成，因为它们易于获得，利用低成本底物，并遵循保留型催化机制 [18], [19], [20]。例如，GH29 α-L-岩藻糖苷酶 BF3242 将岩藻糖基部分从供体 pNP-α-L-Fuc 转移到受体 N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)，生成岩藻糖基化二糖 (Fuc-α-1,3/6-GlcNAc) [21], [22]；EntFuc [23] 和 OUC-Jdch16 [24] 将岩藻糖基部分从 pNP-α-L-Fuc 转移到乳糖以产生 2′-岩藻糖基乳糖。因此，GH29 α-L-岩藻糖苷酶在岩藻糖基化寡糖的酶法合成中具有应用潜力。

目前，表征的 GH29 α-L-岩藻糖苷酶表现出不同的受体利用能力。一些 GH29 酶显示出相对较宽的受体特异性。例如，PbFuc 使用十种不同的糖作为受体进行了转糖基化活性测定，并在七个反应系统中检测到了转糖基化产物 [25]。同样，OUC-Jdch16 也可以将岩藻糖基部分转移到七种糖受体以及甘油 [24]。相比之下，其他 GH29 酶显示出更严格的受体特异性。EntFuc 使用六种糖作为受体进行了转糖基化活性测定；仅当果糖 (Fru) 和乳糖作为受体时才检测到转糖基化产物 [23]。上述大多数关于 GH29 α-L-岩藻糖苷酶受体特异性的研究仅使用单一的糖基供体进行。值得注意的是，除了典型的 α-L-岩藻糖苷酶活性外，一些 GH29 酶还表现出半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶活性 [26], [27]，表明它们具有利用多样化糖作为供体进行转糖基化的潜力。然而，供体类型是否会影响受体特异性及其潜在的调节机制尚不清楚。

GH29 α-L-岩藻糖苷酶通常包括一个 N 端催化结构域和一个或两个碳水化合物结合模块 (CBMs)。催化结构域采用保守的 (β/α)? 或 (β/α)? 状桶状折叠，并包含保守的序列基序，如 HW(F)G 和 HHD(E)，这些基序参与底物结合 [28], [29], [30]。其他结构域采用由 β-链组成的 β-三明治折叠。大多数表征的 GH29 酶具有两个结构域，而包括 FgFCO1 [31]、Bovatus_01698、VeyFCD [26]、BpGH29 [27] 和 GH29_0940 [32] 在内的一小部分包含三个结构域。研究已证实，GH29 α-L-岩藻糖苷酶的 C 端非催化结构域对于蛋白质稳定性和酶活性至关重要。例如，在 VejFCD 中，其 C 端 CBM-B 与催化结构域紧密相互作用；截断该结构域会导致不溶性蛋白表达并改变酶的寡聚状态 [26]。在 AmGH29D 中，其 C 端 CBM32 结构域位于催化区域附近，并被建议介导底物结合 [33]。然而，这些多结构域 GH29 酶的结构数据仍然稀缺，其非催化结构域的具体功能作用，特别是它们可能参与转糖基化，尚未得到充分理解。因此，获取 GH29 α-L-岩藻糖苷酶的更多结构信息对于理解其功能多样性的分子基础（包括观察到的受体特异性差异）至关重要。

在本研究中，表征了一种 GH29A α-L-岩藻糖苷酶，该酶在转糖基化过程中显示出供体依赖的受体特异性。当使用 pNP-α-L-Fuc 作为供体时，PsaFuc 仅识别 Fru 作为受体；相比之下，当使用 oNP-β-D-半乳糖 (oNP-β-D-Gal) 作为供体时，它能容纳多种单糖受体。结构分析表明，PsaFuc 的 C 端非催化结构域 C 参与形成底物结合口袋，以不同的结合亲和力结合供体糖基部分 (L-Fuc 和 D-Gal)。分子动力学 (MD) 模拟和诱变分析进一步证实，不同供体糖基部分的结合改变了受体口袋的空间限制，从而调节 PsaFuc 的受体特异性。这些发现为蛋白质工程提供了扩展酶受体谱的新策略，并促进多样化寡糖的酶法合成。

章节摘要

PsaFuc 在转糖基化中表现出供体依赖的受体特异性

在我们之前的研究中，表征了一种属于 GH29A 亚家族的 α-L-岩藻糖苷酶 PsaFuc。PsaFuc 能够水解人工底物 pNP-α-L-Fuc 和 oNP-β-D-Gal，表现出双重 α-L-岩藻糖苷酶和 β-D-半乳糖苷酶活性 [34] (图 S1)。进一步测定了 PsaFuc 对这两种底物的米氏动力学参数 (表 S1)。使用 pNP-α-L-Fuc 获得的 K_m 为 0.275 ± 0.034 mM，k_cat 为 2.28 ± 0.10 s^?1，这与我们之前报告的

讨论

在本研究中，我们发现 PsaFuc 在转糖基化中表现出供体依赖的受体特异性，这是由 C 结构域的构象变化调节的，这些变化改变了受体口袋的空间限制。非催化结构域在糖苷水解酶转糖基化中的重要性已在几个 GH 家族中得到证明。例如，Bandi 等人报道，GH5 CeIE 的亲核残基突变体在转糖基化方面表现出约 60 倍的改进

结论

在本研究中，我们发现 PsaFuc 在转糖基化反应中表现出供体依赖的受体特异性。结构分析和 ITC 实验揭示了供体糖基部分结合的差异。MD 模拟和诱变实验进一步证实，这些结合差异导致 C 结构域发生不同的构象变化，进而影响受体结合口袋的空间限制，最终调节 PsaFuc 的受体特异性。

PsaFuc 及其突变体的表达与纯化

PsaFuc 的表达和纯化遵循之前建立的方法 [34]。在本研究中，突变体是使用 QuikChange 定点突变方法产生的，并通过 DNA 测序验证。然后按照与野生型蛋白相同的程序对突变体进行表达和纯化。

转糖基化活性测定

以 20 mM pNP-α-L-Fuc 或 oNP-β-D-Gal 作为供体，以 60 mM 多种糖类（乳糖、麦芽糖、乳果糖、蔗糖，）测定 PsaFuc (1700 U/mL) 的转糖基化活性，

CRediT 作者贡献声明

耿鑫：写作 - 审查与编辑，写作 - 初稿，可视化，验证，软件，调查，形式分析，数据整理。吕千千：软件，调查。王旭民：验证，软件，资源，方法论。刁晓通：软件，数据整理。武大雷：形式分析，概念化。刘伟志：写作 - 审查与编辑，写作 - 初稿，监督，方法论，调查，资金获取，数据整理，概念化。

竞争利益声明

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

本工作得到了 中央高校基本科研业务费，中国海洋大学 (编号 202562016) 的支持。我们要感谢中国海洋大学海洋生命学院大型仪器共享平台。

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