**Bacillus cereus AH52中的浓度依赖性代谢转换：蛋白质组重塑驱动了硒酸盐解毒和纳米颗粒合成的双重策略**

《Chemical Engineering Journal》：A concentration-dependent metabolic shift in Bacillus cereus AH52: Proteome remodeling drives a bifurcated strategy for selenate detoxification and nanoparticle synthesis

　　•在Bacillus cereus AH52中发现了硒酸盐代谢的浓度依赖性变化。•20 mM的Se(VI)会触发细胞防御机制、还原酶的产生以及外排作用，但不会形成Se(0)。•200 mM的Se(VI)会增加NADPH和氧化还原酶的水平，从而促进Se(0)的生成。•外源性硫胺素可以增强TKT/PGD活性并提高硒酸盐的还原速率。•这是首次报道细菌硒酸盐解毒过程中存在硫胺素-PPP-NADPH-氧化还原轴。

硒（Se）是一种半金属元素，对人类和动物来说是重要的微量元素。它在多种关键代谢途径中起着重要作用，包括抗氧化防御系统、甲状腺激素代谢、生长调节和免疫功能[1]、[2]。然而，硒的必需浓度和毒性浓度之间的范围非常狭窄，每天摄入超过400微克可能会对人类健康产生不利影响[3]。研究表明，硒缺乏与多种健康问题有关，包括骨骼代谢受损、不育、生长迟缓和认知能力下降[4]、[5]，而过量摄入硒则可能导致胃肠道紊乱、指甲变形和脱发等问题。无论是人类活动（如金属加工过程、化石燃料燃烧和农业灌溉）还是自然过程（如矿物风化）都可能将硒释放到环境中。最近的研究表明，煤矿和发电厂周围土壤中的硒含量比背景水平高出50倍，表明存在严重污染。随着土壤物理和化学特性的变化，土壤中的硒残留物仍具有迁移和转化的能力，这可能危及土壤、饮用水甚至食物链。在印度西北部，使用含硒量较高的灌溉水会导致农业土壤和农产品中硒的积累[6]。20世纪80年代，加州Kesterson野生动物保护区和水库的观察发现，高浓度的硒导致水生鸟类死亡以及胚胎畸形和鱼类中毒，这引起了人们对这一元素环境影响的关注[7]。

硒的化学形式主要决定了其生物利用度和环境行为[8]。自然界中的硒物种包括无毒的元素硒[Se(0)]、有毒的硒酸盐（SeO42?）和亚硒酸盐（SeO32?）、不稳定的硒化物（Se2?）以及有机硒化合物（如硒代蛋氨酸（Se-Met）。由于无机硒酸盐和亚硒酸盐具有极高的毒性并对水生栖息地有害，它们是对环境最危险的物质之一。此外，它们的高生物利用度和溶解性使得植物和动物更容易从受污染的土壤或水中吸收这些物质，从而使硒进入食物链并对人类健康构成严重威胁[9]。在中国湖北省恩施地区，这个著名的高硒区，平均每日硒摄入量为2144微克（来自谷物、蔬菜、肉类和饮用水），导致血液中的硒浓度达到3248微克/升，这对当地人口构成了慢性硒中毒的严重风险[10]。另一方面，元素硒[Se(0)]的溶解度较低且毒性相对较低。多种微生物能够将有害形式的硒（如硒酸盐和亚硒酸盐）转化为无毒的Se(0)，使其在硒的生物地球化学循环中起着重要作用。生成的生物硒(0)容易从水溶液中分离出来，因为它主要以硒纳米颗粒（SeNPs）的形式存在。此外，合成硒纳米颗粒在许多其他行业中也有广泛应用，包括半导体制造、电子制造、玻璃和橡胶生产以及生物医学应用。因此，微生物将无机硒酸盐和亚硒酸盐转化为Se(0)并同时形成生物硒纳米颗粒，为硒污染场所的环境修复提供了一种有前景的策略。

已经有多种细菌被证明可以将Se(IV)还原为SeNPs，包括Burkholderia fungorum [11]、Azospirillum brasilense [12]、Stenotrophomonas maltophilia SeITE02 [13]、Lactiplantibacillus plantarum BSe [14] 和 Bacillus subtilis [15]，以及真菌物种Aureobasidium melanogenum I15 [5]。微生物中Se(IV)的还原可以分为酶促途径（涉及亚硫酸盐还原酶、周质钼氧化还原酶（SerT）、硫氧还蛋白还原酶和砷酸盐还原酶（ArsC））和非酶促途径（涉及谷胱甘肽、铁载体和硫化氢[16]、[17]）。然而，已知只有少数微生物能够还原SeO42?，相比之下，在各种环境中记录了大量的能够还原Se(IV)的微生物种类。最早被发现能够在厌氧呼吸中以硒酸盐作为最终电子受体的细菌是Thauera selenatis [18]。尽管目前对微生物硒酸盐还原的理解主要基于少数模式生物或在厌氧条件下进行的研究，例如Enterobacter cloacae SLD1a1、Comamonas testosteroni S44、Bacillus selenatarsenatis SF-1和Pseudomonas stutzeri NT-I [17]、[19]、[20]、[21]，但未来研究需要通过发现新的硒酸盐还原菌株并阐明其潜在的还原机制来扩展这一有限的多样性。

微生物对Se(VI)的还原通常通过两步机制进行。首先，Se(VI)被运输穿过细胞膜，然后在细胞内被还原为Se(IV)，这一过程主要由特定的或非特定的还原酶催化。随后，Se(IV)被转化为Se(0)或其他含硒化合物。运输是硒代谢的第一步。文献中描述了几种将硒运输到细胞内的方法，结果表明，由于硒酸盐和硫酸根阴离子之间的物理化学和结构相似性，硫酸盐转运蛋白/硫酸盐 permease可能参与了硒酸盐的吸收[15]、[17]。膜结合的呼吸酶SrdBCA和周质硒酸盐还原酶（Ser）在B. selenatarsenatis SF-1和T. selenatis中分别对硒酸盐的还原起着关键作用[19]。在C. testosteroni S44的细胞质和E. cloacae SLD1a-1的细胞质膜中也发现了其他通用硒酸盐还原酶[17]、[21]。例如，在C. testosteroni S44中观察到硫酸盐和硒酸盐还原之间的竞争关系。破坏参与硫酸盐吸收的关键基因（包括硫酸盐转运基因cysA、ATP硫酸化酶基因cysN和亚硫酸盐还原酶基因cysI）会阻止Se(VI)还原为红色元素硒纳米颗粒。综合这些结果表明，吸收性硫酸盐还原途径对该菌株的硒酸盐代谢至关重要[17]。尽管在多种微生物中已经详细描述了亚硒酸盐的还原途径，但在好氧细菌中硒酸盐还原的分子基础仍知之甚少，目前的知识主要来自少数物种。

尽管转录组学和蛋白质组学分析已被广泛应用于表征暴露于硒酸盐的细菌的基因表达和还原机制，但它们在硒酸盐还原菌株中的应用仍然仅限于少数分离株。在Herbaspirillum sp. WT00C中，高浓度硒酸盐（200 mM）处理会诱导细胞形态和表面结构的显著变化，同时抑制DNA聚合酶III α亚基和RNA解旋酶的表达。这种情况还会刺激NADPH的产生并上调硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶的表达，从而共同促进氧化还原平衡并增强菌株对硒酸盐毒性的耐受性[4]。此外，大多数关于细菌对Se(VI)抗性的研究都是在单一浓度下进行的，并且主要关注特定基因而非整个细胞的反应。事实上，Se(VI)还原细菌的转录反应可能会因Se(VI)浓度的不同而不同。Pinel-Cabello等人[22]研究了Stenotrophomonas bentonitica BII-R7在50 mM和200 mM浓度下的Se(VI)抗性机制。虽然在50 mM浓度下未观察到Se(VI)还原为Se(0)，但多个基因的表达显著增强，包括编码呼吸硝酸盐还原酶和抗氧化酶（如谷胱甘肽过氧化物酶）的基因。然而，在200 mM硒酸盐处理下，细胞内合成了硒纳米球。遗憾的是，在200 mM处理下所有基因都显著下调，可能是因为高金属浓度引起的毒性。因此，不同浓度硒酸盐下硒抗性和Se(0)合成的精确还原机制仍有待进一步阐明。由于缺乏组学数据，系统地理解负责Se(VI)解毒和还原的细胞途径受到了限制。

本研究调查了好氧细菌Bacillus cereus AH52的硒酸盐抗性和还原机制，这是一种最近分离出来的具有浓度依赖性Se(VI)转化能力的菌株。尽管该细菌部分还原了20 mM的Se(VI)，但只有在高浓度硒酸盐（≥50 mM）下才会产生Se(0)。这表明其还原能力具有浓度依赖性。这种差异反应的分子基础尚不清楚，需要进一步研究。本研究采用综合蛋白质组学、酶学和遗传学方法来阐明Se(VI)抗性的分子机制，并表征B. cereus AH52产生的生物硒纳米颗粒。我们的发现揭示了该菌株如何通过调节蛋白质组来同时解毒和生物矿化硒，为微生物适应金属压力提供了新的见解。这可能有助于开发针对性的生物修复策略和可持续的生物纳米材料合成。

**硒酸盐还原菌株的分离与鉴定**
在中国的滁州市石台县（30°12′N, 117°22′E）富含硒的土壤区域收集了土壤样本。为了分离具有硒酸盐还原活性的细菌，将0.5克土壤悬浮在含有100 mM钠硒酸盐（Na2SeO4，Sigma-Aldrich）的100 ml灭菌YEP培养基中，然后在30°C和180 rpm下振荡孵育1小时。将系列稀释液接种到含有100 mM Na2SeO4的YEP琼脂上，并在37°C下培养24小时。

**硒酸盐还原菌株AH52的分离与鉴定**
来自富硒陆地生态系统的微生物是修复硒污染环境的理想选择，因为它们可以将Se(VI)或Se(IV)转化为Se(0)。已经从受硒污染的沉积物或土壤中成功分离出多种硒酸盐还原细菌，包括Bacillus sp. SF-1 [30]、P. stutzeri [31] 和 C. testosteroni S44 [32]。本研究报告了一种新的细菌菌株AH52的分离，该菌株来自含硒土壤。

**结论**
本研究揭示了Bacillus cereus AH52在硒酸盐解毒和生物矿化过程中表现出的浓度依赖性的多层次分子策略。通过综合全球蛋白质组学、酶学分析和体内异源验证，我们表明AH52菌株表现出显著的代谢可塑性。总之，B. cereus AH52在中等压力（20 mM）下从节能排斥模式转变为高通量还原生物矿化模式。

**作者贡献声明**
Wang Yuting：方法学、研究、资金获取。
Guo Wanying：可视化、研究。
Jiang Yulu：形式分析、数据管理。
Wang Jing：形式分析、数据管理。
Meng Bo：资源、形式分析。
Zhang Huaxu：资源、形式分析。
Huang Shengwei：写作-审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、概念化。

**撰写过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明**
在准备本工作时，作者使用ChatGPT来改进语言表达。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

**未引用参考文献**
[45], [59]

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

**致谢**
本研究得到了安徽省自然科学基金（2108085QC88和2008085MC60）以及安徽省教育厅重点项目（KJ2021A0881）的支持。