《Chemical Engineering Journal》：Engineered microbial consortium for coordinated production and delivery of siRNA and tumor neoantigen to suppress tumor immune evasion
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•开发了一种工程化双菌株微生物菌群用于肿瘤免疫治疗。•负载siYthdf1的外膜囊泡（OMVs）沉默了YTHDF1并增强了MHC-I相关的抗原呈递。•SecN22实现了CT26来源的肿瘤新抗原的高效胞外分泌。•该菌群表现出显著的抗肿瘤效果，并增强了抗原呈递细胞（APC）的激活
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开发了一种工程化双菌株微生物菌群用于肿瘤免疫治疗。
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负载siYthdf1的外膜囊泡（OMVs）沉默了YTHDF1并增强了MHC-I相关的抗原呈递。
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SecN22实现了CT26来源的肿瘤新抗原的高效胞外分泌。
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该菌群表现出显著的抗肿瘤效果，并增强了抗原呈递细胞（APC）的激活及抗肿瘤T细胞反应。
引言
肿瘤免疫治疗在多种恶性肿瘤中展现出显著的临床潜力 [1]、[2]、[3]。随着合成生物学和基因工程的发展，工程化微生物活体疗法为肿瘤免疫治疗提供了新的技术平台 [4]、[5]、[6]、[7]。与传统的体外药物递送方法相比，工程化细菌可作为活体治疗平台，在体内局部产生功能性分子，包括核酸 [8]、[9]、免疫调节性蛋白或肽 [10]、[11]，从而减少重复给药的需求以及复杂的体外制备程序。这为肿瘤免疫微环境的局部调控提供了新的可能性。然而，目前大多数用于肿瘤治疗的工程化细菌策略仍然主要依赖单菌株系统来执行特定的治疗功能。当一个菌株需要合成多种治疗产物时，往往会面临增加的代谢负担、转录和翻译竞争以及非正交调控，导致功能产物之间的相互干扰，尤其是大分子（如蛋白、RNA） [12]、[13]。因此，工程化细菌肿瘤治疗迫切需要改进，以便在肿瘤内协调产生多种治疗分子，并实现对多种免疫过程的联合调控。
利用工程化微生物菌群为应对这些挑战提供了一种有前景的策略。与单菌株系统相比，微生物菌群可以将复杂的生物合成和调控过程分配给不同的细胞，从而减轻单个宿主的代谢负担，减少不同功能模块之间的资源竞争，并通过调节菌株组成和比例实现更灵活的功能输出 [14]、[15]、[16]。在合成生物学驱动的生物技术制造系统中，复杂的代谢途径已被分配给不同的菌株，通过微生物成员之间的功能分工、代谢互补和动态调控来提高目标产物的合成 [17]、[18]、[19]。在农业领域，合成微生物群落也被用于整合多种功能，包括固氮、溶磷、促生、抑病以及缓解盐碱或干旱胁迫，从而协同提高作物生长和土壤健康 [20]、[21]、[22]。在生物医学领域，工程化微生物菌群也被应用于治疗场景，不同的工程化菌株通过功能分工、协同载荷产生和代谢偶联来实现整合性的治疗输出。这些研究表明，工程化微生物菌群可以通过定义明确的功能分工和模块化协作实现单菌株难以完成的复杂生物功能。
将功能分工和协同调控的设计原理引入肿瘤免疫治疗，可能有助于克服单菌株治疗系统的局限性。肿瘤免疫逃逸涉及多个相互关联的免疫过程，包括肿瘤抗原呈递受损和抗原呈递细胞激活不足 [23]、[24]、[25]、[26]。肿瘤内源性YTHDF1升高可通过调控组织蛋白酶D和组织蛋白酶S促进MHC-I分子的溶酶体降解，从而减少肿瘤细胞表面MHC-I-肽复合物的丰度，并削弱细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的识别 [27]、[28]、[29]。同时，肿瘤微环境中免疫原性抗原的有限可用性可能限制抗原呈递细胞的抗原摄取和呈递，导致下游抗肿瘤免疫反应激活不足 [30]、[31]、[32]。因此，可以为不同的工程化细菌菌株分配不同的治疗任务，一个菌株解决肿瘤抗原呈递受损的问题，另一个菌株增强局部抗原刺激和抗原呈递细胞激活。通过空间共定位和功能互补，这种工程化微生物菌群可以在减轻每个个体菌株表达负担的同时，协调调控多种免疫过程，从而实现对肿瘤免疫微环境的多层次和模块化重塑。
基于这一概念，我们开发了一种由两种功能互补的大肠杆菌菌株组成的工程化微生物菌群，以增强肿瘤免疫原性并抑制肿瘤免疫逃逸。采用皮下CT26肿瘤模型进行概念验证，因为它可以在免疫健全的BALB/c小鼠中重复建立，并且便于进行纵向肿瘤监测和标准化的瘤内给药 [30]。基于我们先前建立的用于体内产生和OMV介导的RNA货物递送的细菌平台 [8]、[9]，我们将此策略应用于siYthdf1的递送。在该平台中，siRNA介导序列特异性基因沉默，而OMVs保护RNA货物并促进其向哺乳动物细胞的功能性递送。因此，一个细菌模块产生负载siYthdf1的OMVs以沉默肿瘤细胞中的YTHDF1，恢复MHC-I表达，并改善肿瘤抗原呈递 [27]、[28]、[29]。与此同时，BL21 SecN22-Neo表达并释放CT26-M03，这是一种源自Slc20a1中T425I突变的经确认的CT26来源新抗原，从而增强局部抗原刺激并促进抗原呈递细胞和效应免疫细胞的激活 [30]、[31]、[32]。通过空间共定位和功能互补，这两种菌株有望共同缓解肿瘤免疫逃逸并增强局部抗原刺激，从而促进抗肿瘤免疫并改善治疗效果。
章节摘要
细菌菌株和质粒构建
大肠杆菌 DH5α 用于质粒构建和扩增，而大肠杆菌 BL21 作为质粒转化和功能验证的宿主菌株。高产OMV的 BL21-ves 菌株由江南大学生物技术学院教育部工业生物技术重点实验室刘春丽教授实验室惠赠。pJET1.2 质粒被用作构建表达载体的骨架。完整序列
siYthdf1生产菌群模块的构建与功能验证
我们构建了一个能够原位产生负载 siYthdf1 的 OMVs 的工程化细菌平台。该 OMVs 在体内的潜在递送旨在对抗由 YTHDF1 过表达介导的肿瘤免疫逃逸，后者可能下调肿瘤细胞表面的 MHC-I-抗原肽复合物。为了增强负载 siYthdf1 的 OMVs 的生产，我们采用了两种工程策略。首先，我们选用了高囊泡化的 BL21-ves 菌株，该菌株表现出增强的 OMV
讨论
肿瘤免疫逃逸是限制癌症免疫治疗疗效的主要障碍之一 [38]。其发展并非由单一因素驱动，而是涉及肿瘤抗原可识别性不足、抗原呈递受损以及免疫抑制性肿瘤微环境之间的复杂相互作用。因此，仅通过单一路径的干预往往无法实现强大的抗肿瘤免疫激活。在本研究中，以"降低阈值"的概念为指导
CRediT 作者贡献声明
孙大伟：撰写—初稿，方法学，调查研究。李龙：验证，方法学，调查研究。黄鑫：验证。唐小芳：调查研究。刘海：调查研究。周涵雁：调查研究。李欣然：调查研究。白桂杰：调查研究。冯志杰：撰写—审阅与编辑。刘铎：撰写—审阅与编辑，资金获取。王汉杰：撰写—审阅与编辑，资金获取，概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到以下资助支持：国家自然科学基金（32571637）；海南省重点研发计划（ZDYF2026GXJS003）；天津市杰出青年自然科学基金（23JCJQJC00210）；国家自然科学基金委京津冀基础研究联合基金重点项目（23JCZXJC00370）；上海市"先锋计划"生物混合机器人项目（25XF3200800）；国家重点实验室开放基金项目
孙大伟|李龙|黄鑫|唐小芳|刘海|周涵雁|李欣然|白桂杰|冯志杰|刘铎|王汉杰
