《PLOS Computational Biology》：ASPIRE: Accurate alternative splicing prediction from limited RNA sequencing data and a minimal gene set
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可变剪接（alternative splicing，AS）是真核生物中增加蛋白质多样性并调控关键细胞过程的基本生物学机制。剪接失调与包括癌症、神经系统疾病和自身免疫病在内的多种疾病相关。因此，准确预测诸如百分比剪接入（percent spliced in，PS
可变剪接（alternative splicing，AS）是真核生物中增加蛋白质多样性并调控关键细胞过程的基本生物学机制。剪接失调与包括癌症、神经系统疾病和自身免疫病在内的多种疾病相关。因此，准确预测诸如百分比剪接入（percent spliced in，PSI）等剪接指标，对于理解剪接调控和改善疾病表征至关重要。然而，现有方法通常需要较高的测序深度，因而难以适用于单细抱RNA测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）等低覆盖度场景，其中稀疏读数限制了可靠的剪接分析。研究人员提出ASPIRE（Accurate Splicing Prediction from Limited RNA Sequencing），一种从低深度RNA-seq基因表达数据预测可变剪接指标的深度学习框架。ASPIRE从读数覆盖有限的基因表达谱推断PSI值，并整合嵌入式特征选择机制，识别与剪接调控相关的极小且具信息量的基因子集。该设计在实现准确预测的同时，减少了对大量测序的依赖，并缓解了无关或弱信息基因引入的噪声。通过聚焦包括RNA结合蛋白在内的具有生物学意义的特征，ASPIRE即使在单细胞转录组典型条件下仍保持强劲预测性能。研究人员证明ASPIRE在包括单细胞RNA-seq特征在内的多种测序深度下准确预测PSI，在模拟与真实数据集上性能相当或优于现有方法。通过实现从稀疏数据中进行稳健的基于表达的剪接推断，ASPIRE促进了在细胞分辨率下研究可变剪接，并为开发、疾病及异质性细胞群中的剪接调控研究提供实用框架。
研究背景方面，可变剪接（alternative splicing，AS）使单个基因产生多种蛋白质亚型，其失调涉及癌症、神经疾病与自身免疫病等多类疾病。传统批量RNA测序（bulk RNA-seq）虽测序深度高但掩盖细胞异质性，而单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）虽能解析细胞水平表达却因每细胞读数极低、剪接junction覆盖不足，导致基于junction的PSI估计大量缺失。现有工具如DeepPSI、SCATS、BRIE、MARVEL在低深度下性能急剧下降。为此，研究人员开发ASPIRE（Accurate Splicing Prediction from Limited RNA Sequencing），一个从低深度基因表达（TPM）直接回归PSI的深度学习框架，论文发表于《PLOS Computational Biology》。
关键技术方法上，研究人员以GTEx v7批量RNA-seq为金标准，通过seqtk对FASTQ按500K、100K、10K读数无放回抽样构建伪单细胞TPM；以全深度bulk计算的PSI为ground truth；外部真实scRNA-seq队列包括小鼠多发性硬化GSE113973（BRIE2参考）与人hiPSC定向内胚层分化PRJEB15062（MARVEL参考）。模型为带Stochastic Gates（STG）嵌入式特征选择的深层神经网络，输入基因为全基因组或指定池（RBP、housekeeping、随机），推断采用Monte Carlo dropout（100次）量化不确定性；对照方法含LASSO、MLP、BRIE2、MARVEL。
研究结果部分，ASPIRE accurately predicts percent spliced in values at low sequencing depths小节指出，在GTEx下采样至500K/100K/10K时，ASPIRE外显子水平Pearson相关分别达0.818/0.774/0.683，显著优于BRIE2（10K时降至0.147）与MARVEL（低深度几乎全缺失）；以CLSTN1 exon3为例，100K SC深度相关0.7820，10K为0.5396，而BRIE2在100K仅0.1946。Benchmarking ASPIRE against existing PSI estimation tools小节汇总跨三独立集比较。Benchmarking MARVEL and BRIE2 on downsampled 100K GTEx Data小节显示MARVEL仅26个事件相关>0.4，BRIE2仅118个，中位相关分别约0.19与0.06。Benchmarking on single-cell RNA-seq data from multiple sclerosis (Mouse; GSE113973)小节中ASPIRE对BRIE2参考最高前10事件相关0.47–0.79。Benchmarking on human HiPSC differentiation data (PRJEB15062)小节在262共享事件上ASPIRE胜136、BRIE2胜126。Consistent evaluation across a defined gene panel小节选9个已知cassette exon基因，全深度下ASPIRE对APP/ADD3/CAMK2D等r=0.90–0.98，随深度缓降，而BRIE2在500K骤降、MARVEL低于全深度即无输出。Non-linear methods achieve the best performance for PSI prediction小节比较LASSO、MLP、ASPIRE，Bulk下ASPIRE r=0.918±0.015、MSE=0.034±0.034，非线性优于线性。ASPIRE enables accurate prediction of exon PSI using only a small gene set小节中STG选出12基因（含MAP4、SRPK1、RBM47等）预测CLSTN1 exon PSI得r=0.946，远超随机12基因集均值0.698。ASPIRE demonstrates predictive robustness through uncertainty quantification with monte carlo dropout小节以100次MC dropout分箱，低不确定度箱r=0.94、高不确定度箱r=0.64，不确定度与绝对误差显著相关。RNA-binding protein genes show better PSI prediction than other gene pools at low sequencing depths小节显示RBP池全深度r高于housekeeping与随机，100K时AS相关RBP子集r=0.705，housekeeping 0.699，随机0.689。Evaluation of predictive robustness through selected vs. random subsets of RNA-binding protein genes小节证STG选RBP子集优于同规模随机RBP。Leave-tissue-out generalization小节在51 GTEx组织留一组织验证，中位组织r=0.89、MSE=0.017，脑相关组织>0.9，Testis与Whole Blood偏低。Stability of selected genes across folds and depths小节跨5折3深度，核心基因NME1、KHDRBS1、NELFE稳定入选，选基因数Bulk 32.6±3.2、100K 40.4±2.3、10K 46.6±2.9。Stratified performance by PSI range and host-gene expression小节按PSI区间与宿主基因表达三分位分层，低PSI（0–0.2）MAE=0.049，高表达宿主基因MAE降至0.071。
讨论与结论部分，研究人员强调ASPIRE核心贡献是在无junction覆盖时仅由TPM回归PSI，于下采样bulk与真实scRNA-seq均与参考具可比性，且在金标准bulk下显著优于junction工具。局限在于伪单细胞由bulk下采样而非真实sc分子捕获，零膨胀与扩增偏倚未完全模拟。特征选择并非给出唯一最优调节因子面板，STG具随机性，但小而紧凑的RBP富集子集足以支撑预测。MC dropout不确定度可作置信过滤。留组织验证表明跨组织可迁移但极端表达背景（睾丸、全血）降级。结论为：ASPIRE构成低深度转录组尤其scRNA-seq中AS计算预测的重要进展，能以最小基因集从表达推断PSI，为发育、疾病异质性与治疗响应中剪接动态研究提供互补于junction方法的实用框架。
