PRDM3和PRDM16在斑马鱼发育过程中调控颅神经嵴细胞的命运

《Differentiation》：PRDM3 and PRDM16 define cranial neural crest cell states in zebrafish development

　　

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  Prdm3和Prdm16与核小体结合以调节基因表达
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  prdm3和prdm16突变体斑马鱼的基因靶点发生改变
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  在相应的突变体中观察到结合能力降低

引言

在颅面发育过程中，多能颅神经嵴细胞（cNCC）分化为特定的细胞类型，这使它们与其他头部细胞不同（Bronner和LeDouarin（2012）；（Le Douarin，1982）。这是因为cNCC可以产生多种细胞类型，包括形成面部结构软骨和骨骼的软骨细胞和成骨细胞，以及色素细胞、周围神经系统的神经元和胶质细胞等衍生物（Minoux和Rijli，2010；Selleri和Rijli，2023）。调控这些分化过程的基因调控网络（GRN）和信号通路必须受到严格控制，因为任何一步的改变都可能导致影响颅面复合体形成的先天性出生缺陷（Simoes-Costa和Bronner，2015；Martik和Bronner，2021；Mitani等人，2006）。

由于神经嵴细胞（NCC）分化的时间和空间顺序非常精确，因此成为许多近期研究的重点。现在已知，高度调控的NCC GRN对于定义不同的细胞命运是必需的。这些独特的细胞状态会在接收到BMPs、Wnts和FGFs等信号后上调特定转录因子的表达。cNCC首先从神经板和非神经外胚层中明确区分出来，从而定义了神经板的边界。在这里，cNCC表达包括sox10、foxd3和snail2在内的神经嵴特异性基因。在指定后，颅NCC经历上皮-间充质转化（EMT）并迁移到咽弓中，在那里它们通过上调col2a1和runx2分别分化为软骨细胞和骨细胞，这是对内皮素信号的反应。cNCC还会与外胚层胚盘细胞混合并迁移到颅神经节区域，形成神经元和胶质细胞（Schlosser，2005）。它们响应Wnt和Shh等信号，并上调神经元标志物elav3, isl1和neurog1以及胶质细胞标志物foxd3的表达（Kurosaka等人，2015）。

表观遗传调节因子通过翻译后修饰组蛋白并改变核小体的稳定性来指导转录机制对DNA的访问，从而实现对基因表达的精确时间和空间控制。越来越多的实验证据表明，表观遗传因素在NCC命运决定和整个颅神经嵴发育阶段起着同样重要的作用（Shull和Artinger，2024；Selleri和Rijli，2023）。许多这类调节因子在人类疾病中也会发生突变。例如，在Xenopus、斑马鱼和小鼠中，依赖于ATP的染色质重塑酶CHD7的缺失会导致颅面缺陷，这些缺陷与携带CHD7突变的人类CHARGE综合征患者的表型相似（Bajpai等人，2010；Hurd等人，2010；Lalani等人，2006；Layman等人，2010；Sperry等人，2014）。同样，人类KAT6A（一种激活基因表达的H3K9乙酰转移酶）的突变会导致Arboleda-Tham综合征，患者具有面部畸形特征。这些疾病表型已在包括小鼠和斑马鱼在内的动物模型中得到复制（Vanyai等人，2019；Voss等人，2012）。

通过人类全基因组关联研究（GWAS），已经确定了属于PRDM家族的两种组蛋白甲基转移酶PRDM3（MECOM/EVI1）和PRDM16会影响正常的人类面部形态（Shaffer等人，2016）。此外，这些基因的SNP与唇裂伴或不伴腭裂有关（Jugessur等人，2010；Li等人，2019；Shaffer等人，2016）。这两种旁系同源基因在许多组织和器官系统的发育过程中深度参与谱系决定。这两种因子通过其内在的甲基转移酶活性对H3K9和H3K4上的赖氨酸残基进行甲基化，和/或通过锌指结构直接结合DNA来调节下游基因的表达，尽管在体内尚未明确证明其内源性酶活性。Prdm3对于造血细胞群体的分化过程至关重要，而Prdm16则控制肌肉细胞和棕色脂肪细胞之间的细胞命运转换（Kajimura等人，2008；Kataoka等人，2011；Sato等人，2008；Seale等人，2008）。最近的研究还表明，这两种因子都参与肺细胞命运的确定（He等人，2024）。在神经嵴发育过程中，Prdm3和Prdm16在颅面复合体内强烈表达，并且对斑马鱼和哺乳动物的颅面软骨细胞的成熟和分化起着重要作用。在小鼠中，Prdm3空缺突变体胚胎是胚胎致死的，而在Wnt1-Cre驱动因子控制下的神经嵴条件性消融会导致Meckel软骨细胞紊乱，表明软骨细胞分化存在缺陷（Shull等人，2022；Shull等人，2020）。Prdm16空缺动物和神经嵴特异性条件性消融会导致腭裂缺陷、异常的软骨细胞分化以及下颌骨发育不全（Bjork等人，2010；Shull等人，2022；Shull等人，2020；Warner等人，2013）。此外，我们之前在斑马鱼中证明prdm3和prdm16旁系同源基因通过时空平衡Wnt/β-连环蛋白的活性来促进软骨分化，既在转录水平上也在表观遗传层面上通过控制下游Wnt/β-连环蛋白靶点的染色质可访问性（Shull和Artinger，2024；Shull等人，2022）。然而，它们在神经嵴发育中的直接转录和染色质靶点仍大部分未知。

在这里，我们对神经嵴细胞进行了CUT&RUN分析，以进一步确定Prdm3和Prdm16的直接转录靶点。通过分析CUT&RUN片段大小分布，我们评估了转录因子的活性模式：小DNA片段表示直接DNA结合，而较大片段表示核小体结合（Skene和Henikoff，2017；Tonsager等人，2025；Trouth等人，2024）。CUT&RUN数据集中的大部分峰值来自核小体大小的片段，表明Prdm3和Prdm16与核小体结合。此外，基于Prdm3、Prdm16和H3K27ac的富集情况，我们能够识别出6个峰群。与这些峰相关的基因在基因本体（GO）术语上显示出差异性富集，预测这些基因受Prdm3或Prdm16单独或共同调节。为了确定Prdm3/Prdm16的结合模式是否决定了靶基因的调控方式，我们使用HCR原位杂交技术在48 hpf时检查了每个峰群中代表性基因的表达，结果表明prdm3和prdm16突变体的靶基因表达发生了变化。最后，我们在prdm3和prdm16突变体斑马鱼胚胎中进行了CUT&RUN qPCR分析，确定了基于峰群所属的靶点的Prdm3和Prdm16结合情况。

章节片段

斑马鱼饲养

斑马鱼的饲养方法如前所述（Westerfield，2000）。使用的野生型（WT）品系为AB（ZIRC），突变体品系为prdm3^co1013（称为prdm3^-/-）和prdm16^co1027（称为prdm16^-/-）。所有实验均经过明尼苏达大学（协议#2210-40517A）和新墨西哥大学（协议#24-201487-B-MC和#24-201481-MC）的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准，并符合NIH的监管要求

Prdm3和Prdm16在基因组中结合相似和独特的位点

为了确定Prdm3和Prdm16的染色质结合情况，我们在48 hpf的斑马鱼胚胎中FAC分选的Tg(sox10:mRFP) NCC上进行了CUT&RUN分析，使用了针对Prdm3、Prdm16、H3K27ac的抗体以及IgG作为对照。< />细胞主要由整个前后轴的NCC及其衍生物组成，同时也表达于耳囊细胞和中枢神经系统的胶质细胞中。通过CUT&RUN测序数据，我们确定了这些短片段的基因组分布（<80

讨论

在这项研究中，我们通过CUT&RUN分析研究了两种重要的颅面发育调节因子Prdm3和Prdm16的转录因子活性。我们发现这两种因子的结合模式存在差异，与H3K27ac相关，Prdm3和Prdm16假定靶基因的表达变化与它们与这些基因区域的结合有关，而且在突变体中这些相互作用减少。这些数据支持这样的模型：

结论

总之，我们提供了数据支持Prdm3和Prdm16与核小体结合以进行DNA结合的作用。直接鉴定的靶基因主要在咽弓中表达，在Prdm3和Prdm16结合减少的情况下，这些靶基因的表达发生了变化。总体而言，这些结果支持Prdm3和Prdm16在调节cNCC细胞命运决定中的作用，这与它们在其他系统中的作用以及确定祖细胞程序的更广泛背景一致。

CRediT作者贡献声明

Bryanna Saxton：方法学，研究。Qootsvenma Denipah-Cook：方法学，研究。Silvia Meyer-Nava：写作 - 审稿与编辑，方法学，研究。Job Flores：方法学，研究，正式分析。Ezra Lencer：数据管理。Fahmida Raha：写作 - 审稿与编辑，方法学，研究。Julaine Roffers-Agarwal：写作 - 审稿与编辑，方法学，研究。Lomeli Shull：写作 - 审稿与编辑，监督，研究，资金获取，

致谢

我们感谢Artinger实验室的过去和现任成员提供的项目反馈，感谢科罗拉多大学Anschutz分校的Christine Archer、新墨西哥大学的Jennifer Sharp以及明尼苏达大学的Marc Tye和斑马鱼饲养团队的出色动物护理工作。本工作得到了K99/R00 DE0224034对L.C.S.、NIGMS的R35GM156411对S.R.以及NIDCR R01DE030377对K.B.A.的支持。

Lomeli C. Shull|Silvia Meyer-Nava|Bryanna Saxton|Qootsvenma Denipah-Cook|Fahmida Raha|Julaine Roffers-Agarwal|Job Flores|Ezra Lencer|Srinivas Ramachandran|Kristin B. Artinger