通过工程设计3′-UTR发夹结构来调节大肠杆菌（Escherichia coli）中的mRNA稳定性及重组蛋白的产生

《Protein Expression and Purification》：ENGINEERING 3′-UTR HAIRPIN STRUCTURES TO MODULATE MRNA STABILITY AND RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTION IN ESCHERICHIA COLI

　　

摘要

工程化mRNA稳定性是一种有前景但尚未充分探索的方法，可用于提高细菌系统中重组蛋白的产量。在本研究中，我们使用两种SUMO融合表达系统，评估了合成的3′-UTR发夹结构对大肠杆菌中mRNA稳定性和蛋白产量的影响。在编码序列的下游引入了具有明确结构特征的发夹元件。在所有构建体中，3′-UTR发夹结构使mRNA半衰期延长，稳定性提高了约2到3倍（n = 3个生物重复实验）。在SUMO-SARS-CoV-2衍生的肽系统中，转录本的稳定性提高伴随着特定细胞融合蛋白含量的显著增加，相对于对照组增加了多达6.8倍（n = 3）。在SUMO-liraglutide衍生的肽系统中，mRNA的稳定性也有显著提高，特定细胞融合蛋白含量增加了约3倍（p < 0.001，n = 6）。这些发现表明，3′-UTR工程是调节*E. coli*中mRNA稳定性的有效策略，但转录本持久性和蛋白积累之间的定量关系取决于具体情境，并可能受到包括翻译效率在内的其他因素的影响。总体而言，3′-末端RNA结构的工程化为重组表达系统的转录后调控提供了一种实用工具。

引言

在大肠杆菌中高效生产重组蛋白和肽不仅依赖于转录活性，还依赖于mRNA在细胞内的稳定性和持久性（Carpousis,2007; Belasco,2010; Silva F等人,2012）。在工业生物加工相关的条件下，尤其是在高细胞密度培养中，快速的转录本周转会减少每个mRNA分子的翻译事件次数，从而限制蛋白积累（Roux C等人,2022; GJ Gopal和Kumar,2013）。这一限制对于短肽产品尤为重要，因为其生产效率本质上受到序列长度和表达环境的限制，而mRNA的稳定性成为产量的关键决定因素（Deo S.等人,2022; Kaberdin VR和Bl?si,2006; Sadeeq M等人,2025）。因此，mRNA稳定性已成为细菌表达工程中越来越重要的设计目标（Gopal GJ和Kumar,2013; Deo S.等人,2022; Roux C等人,2022）。

大多数增强E. coli中重组表达的方法都集中在转录和翻译控制上，包括启动子强度、核糖体结合位点设计、密码子优化以及质粒拷贝数（Carpousis,2007; Choe D等人,2022; Daniel P. Cetnar等人,2024）。这些方法可以显著增加转录本的形成和翻译起始，但它们并不能直接控制转录本的寿命。相比之下，通过RNA结构设计进行的转录后调控提供了一种在不改变编码蛋白序列的情况下影响表达输出的补充途径。

在细菌系统中，mRNA的稳定性受其转录本结构特征的强烈影响，尤其是在其末端区域。与真核生物的mRNA不同，细菌转录本缺乏5′帽和poly(A)尾等稳定元件，这使得它们更容易降解（Choe D等人,2022）。位于终止密码子下游的3′非翻译区（3′-UTR）在转录后调控中起着核心作用，因为它影响转录终止和RNAprocessing（Asrani KH等人,2018; Menendez-Gil P等人,2021）。在许多情况下，该区域包含rho独立的转录终止子，这些终止子由富GC的茎-环结构组成，后面跟着一个poly(U)序列。这样的元件不仅可以终止转录，还可以减少3′-5′外切核酸酶对转录本末端的接触（Asrani KH等人,2018; Dar D等人,2018; Adams PP等人,2021）。更广泛地说，细菌的3′-UTR现在被认为是功能性调控区域，而不仅仅是被动序列间隔区（Menendez-Gil P和Toledo-Arana,2021; Xu M等人,2022）。

在影响mRNA稳定性的结构元素中，茎-环（发夹）结构是最有效的之一。这类二级结构可以作为物理屏障，阻止外切核酸酶的作用，从而降低降解速率（Kaberdin VR等人,2006; Cetnar DP等人,2021; Deo S.等人,2022; Wang X等人,2023）。它们的稳定效果由热力学参数决定，包括GC含量、茎的长度和环的组合（Vargas-Blanco DA等人,2020; Solodushko V等人,2023）。天然存在的例子包括转录终止子和tRNA样结构（Asrani KH等人,2018; Philip P Adams等人,2021）。因此，合成的终止子样或发夹形成元件已成为转录本工程的潜在有用工具。最近的研究表明，工程化的3′-UTR模块可以调节E. coli中的基因表达，而且终止子相关的结构特征可以以可测量和可设计的方式影响上游mRNA的稳定性（Pfleger BF等人,2006; Vargas-Blanco DA和Shell,2020; Choe D等人,2022; Liu M等人,2024; Jia-Wei Ren等人,2025）。同时，现有文献也指出，仅凭热力学稳定性不足以解释或预测mRNA在体内的行为。最近的大规模实验和建模研究表明，细菌mRNA的寿命取决于多个相互作用的因素，包括RNA结构、核糖体保护、序列环境和替代折叠状态（Vargas-Blanco DA和Shell,2020; Deo S.等人,2022; Chen F等人,2022; Daniel P. Cetnar等人,2024; Liu M等人,2024）。这使得3′-UTR工程在概念上具有吸引力，但也表明不应过于简化设计规则。

从应用的角度来看，对3′末端的转录本稳定性进行工程化是一种相对简单且成本效益高的增强表达的策略。与启动子或编码序列工程不同，这种方法基本上独立于转录控制，不会干扰目标蛋白的氨基酸序列（Pfleger BF等人,2006; Deo S.等人,2022; Niazi SK等人,2023）。

原则上，它可以被引入现有的表达系统中，而不改变目标蛋白的氨基酸序列，也不需要修改宿主基因组（Park YS等人,2007; Jia-Wei Ren等人,2025）。

近年来，在系统评估合成3′-UTR元件用于细菌基因表达工程方面取得了实质性进展。大规模研究量化了细菌操纵子中mRNA稳定性的序列和结构决定因素（Cetnar DP和Salis,2021; Daniel P. Cetnar等人,2024），而专门的研究则剖析了终止子介导的上游mRNA稳定机制（Jia-Wei Ren等人,2025）。合成3′-UTR模块已成功应用于E. coli中的代谢流控制（Choe D等人,2022），并且UTR工程的合理设计框架正在迅速发展（Liu M等人,2024）。然而，将工程化的3′-UTR发夹应用于重组肽生产系统中的具体应用仍较少得到全面探索，尤其是在翻译效率和mRNA稳定性约束与代谢酶表达存在根本差异的情况下。特别是，发夹的热力学稳定性、结构参数及其对生产相关条件下的转录本降解和蛋白产量的影响之间的关系，需要在不同的编码序列环境中进行进一步的实证验证（Chen F等人,2022; Mutalik VK等人,2013）。

在本研究中，我们采用了合理的工程设计方法来生成合成的3′-UTR发夹结构，并评估了它们对E. coli中mRNA稳定性和重组表达的影响。

使用RNA二级结构建模工具预测了所设计元素的热力学性质，并在具有不同序列和结构特征的几个重组肽系统中测试了这些构建体。通过 rifampicin 追踪实验和随后的 RT-qPCR 评估了mRNA的稳定性。Rifampicin 通过与细菌RNA聚合酶的β亚基结合选择性地抑制转录起始，从而能够在新RNA合成停止的情况下测量mRNA的降解。得到的降解曲线符合单相指数模型（y(t) = y₀ × e^(?k×t)），该模型假设mRNA降解速率恒定且转录本群体均匀——这一假设与E. coli在稳态条件下观察到的相对均匀的降解行为一致。蛋白积累通过毛细管凝胶电泳进行量化，本工作的目的是确定引入定义的3′-UTR发夹结构是否可以作为一种实用策略来提高E. coli中的转录本稳定性和重组肽产量。

章节摘要

菌株和质粒

使用大肠杆菌 DH5α（New England Biolabs, USA）进行质粒扩增和克隆，而大肠杆菌 BL21（New England Biolabs, USA）作为表达宿主。编码SUMO-肽4和SUMO-liraglutide的DNA序列经过针对大肠杆菌的密码子优化（ATUM, USA），并已商业化合成。

所有构建体都基于CJSC “Farm-Holding”提供的单个质粒骨架，该骨架包含卡那霉素抗性基因、Tac启动子、rrnB转录终止子和pBR322

mRNA的二级结构

使用RNAfold分析了控制序列和两个含有发夹变异体的mRNA转录本的二级结构（图1）。对于控制序列，最优结构的最低自由能（MFE）为-38.91 kcal/mol，热力学集合的自由能为-75.09 kcal/mol，集合多样性为57.16，MFE-结构频率为0.79%。对于含有发夹变异体1的构建体，MFE为-62.70 kcal/mol，集合自由能为-83.31

讨论

在所有测试的构建体中，将发夹结构引入3′-UTR后mRNA稳定性均得到提高。然而，对特定细胞融合蛋白含量的影响因表达系统而异。在SUMO–SARS-CoV-2衍生的肽系统中（BL21\pF1222、BL21\pF1252、BL21\pF1310），mRNA半衰期增加了约2.4倍，同时蛋白产量显著增加，BL21\pF1252增加了约6.8倍，BL21\pF1310增加了约4.4倍。

CRediT作者贡献声明

Zukhra Khasanshina：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，方法学，数据管理，概念化。Marina Yarovikova：撰写 – 原稿，方法学，研究，形式分析。Evgeniya Buslaeva：研究，数据管理。Anton Filipenko：研究，形式分析。Roman Drai：监督，项目管理

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

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生成式AI声明

在准备本手稿期间，作者使用了ChatGPT来改进文本的语言和可读性。作者根据需要对手稿进行了审阅和编辑，并对其内容负全责。

资助

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