重组人血管内皮生长因子B167在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗氧化活性

《Protein Expression and Purification》：Expression, Purification and Antioxidant Activity of Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor B167 in Escherichia coli

　　

摘要

年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人视力障碍的主要原因，其核心病理机制是氧化应激。本文在大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）BL21中开发了一种原核表达系统，用于生产重组人血管内皮生长因子B 167（VEGFB167）。在系统优化表达和纯化参数后，实验验证了目标蛋白的抗氧化能力。VEGFB167以包涵体的形式高效表达。经过色谱纯化后，蛋白质纯度达到97%，浓度为1.4 mg/mL。细胞功能实验表明，VEGFB167显著降低了活性氧、丙二醛和乳酸脱氢酶的释放，增强了超氧化物歧化酶（SOD1/SOD2）的活性和基因表达水平，抑制了细胞凋亡，并促进了细胞增殖。这些结果为将VEGFB167作为治疗由氧化应激引起的疾病（如AMD）的生物制剂提供了依据。

引言

AMD是65岁以上老年人视力障碍的主要原因，现有的预防和治疗策略有限^[1]。随着年龄增长，视网膜的生理代谢逐渐恶化，对外部氧化应激（尤其是紫外线和蓝光引起的损伤）的抵抗力下降^[2]。临床研究证实，AMD患者的视网膜抗氧化酶超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、细胞色素C氧化酶和谷胱甘肽还原酶的活性显著降低^[3]。抗氧化酶活性的下降会损害视网膜的氧化磷酸化功能，导致活性氧（ROS）过度积累，从而引发视网膜细胞退化和功能障碍^[4]。综上所述，氧化应激是AMD的核心致病因素，抗氧化干预是一种有前景的治疗方法。

VEGFB是VEGF家族的关键成员，是一种强有力的抗氧化细胞因子，在神经保护、脂质代谢调节和抗氧化基因调控中发挥重要作用^[5],[6],[7]。VEGFB于1996年首次被鉴定，是一种21 kDa的蛋白质，含有VEGF家族特有的PXCVXXX-RCXGC序列，与VEGFA的氨基酸序列同源性为47%^[8]。它通过与血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）和神经纤毛蛋白-1（NRP1）结合来发挥生物学作用。VEGFB有两种主要异构体：VEGFB167和VEGFB186^[9]。广泛分布的VEGFB167占VEGFB转录本的80%以上，而VEGFB186则具有组织特异性表达，表明VEGFB167是主要的功能性异构体^[10]。在病理条件下，VEGFB167通过上调抗氧化基因和下调与氧化应激相关的基因来保护视网膜细胞，从而提高视网膜细胞的稳定性并抑制细胞凋亡。鉴于其强大的抗氧化和视网膜保护作用，生物活性VEGFB167被视为预防和治疗AMD的有希望的候选药物。

大肠杆菌表达系统具有成熟的纯化技术、简单的发酵操作、较短的实验周期和高蛋白产量，已成为异源蛋白表达的经典高效平台^[11]。因此，本研究采用大肠杆菌表达系统来表达VEGFB167，随后优化了纯化条件，并对其抗氧化活性进行了研究。

章节片段

分子克隆

VEGFB167被克隆到pbv220表达载体中。小鼠VEGFB167的共有编码序列来自CCDS数据库（CCDS：CCDS58144.1），与RefSeq转录本NM_001243733.2一致。最终的VEGFB167构建序列为：MPVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQRPDPRTCRCRCRRRSFLRCQGRGLELNPDTCRCRKLRRGSHHHHHH。该基因序列已针对大肠杆菌的表达进行了密码子优化

VEGFB167的表达和纯化

在诱导后4小时和16小时收集的样本以及细胞裂解后的上清液和包涵体部分的比较显示，VEGFB167主要位于包涵体中（图1a）。延长诱导时间并未提高表达水平；因此，后续所有实验均采用4小时的诱导时间。

VEGFB167通过亲和色谱法从可溶化的包涵体中纯化出来。平衡后，使用...

讨论

随着人口老龄化程度的加剧，由代谢衰退引起的年龄相关疾病发病率逐渐增加。氧化应激失衡是多种退行性和损伤性疾病的中心病理机制，它会导致细胞氧化损伤、过度凋亡和增殖抑制^[16]。对内源性功能性细胞因子及其生物活性制剂的研究已成为当前研究重点

CRediT作者贡献声明

Hongli Zhao：写作——审阅和编辑。Jianwei He：写作——审阅和编辑。Shuo Zhang：撰写初稿。Manman Song：数据管理。Ling Feng：数据可视化。Huiying Kang：方法学设计

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了辽宁省教育厅项目的财政支持（LJKZZ20220155）。

Shuo Zhang|Manman Song|Ling Feng|Huiying Kang|Hongli Zhao|Jianwei He

辽宁大学生命科学学院，沈阳，110036，中国