半间歇蛋白质聚乙二醇化的过程强化：多变量设计空间表征与稳健工艺指南

《Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers》：Process intensification of semi-batch protein PEGylation: Multivariate design space characterization and robust process guidelines

　　

摘要

背景

半间歇操作在蛋白质 PEG 修饰的过程强化方面提供了巨大的潜力；然而，对设计空间的系统表征以了解过程行为并确定稳健的操作条件仍然有限。

方法

在本研究中，通过改变五个关键工艺参数：循环时间、PEG 进料浓度、排出（排放）百分比、总 PEG 与蛋白质摩尔比以及初始 PEG 与蛋白质摩尔比，对半间歇溶菌酶 PEG 修饰进行了全面的 144 例因子设计。应用了包括多元方差分析（ANOVA）、主成分分析（PCA）和相关性分析在内的多元统计分析，以量化变量重要性，阐明指标间的相互依赖关系，并绘制性能图谱。

重要发现

相对于批次对照组，在半间歇操作中可以轻易提高 PEG 产率和选择性，分别实现了三倍和四倍的改善。生产力的提升在设计空间的狭窄范围内实现，这需要仔细选择操作条件。ANOVA 确定排出比和循环时间为主导变量，而 PCA 揭示了转化率和整体过程性能之间的基本权衡。此外，PCA 显示纯度/通量与试剂利用率之间建立了一种权衡，这种权衡是通过利用四种工业相关权重方案的情景评估来实现的。评估确定了两个操作条件（案例 45 和 43），它们在各个目标上都提供了高性能。

引言

蛋白质 PEG 修饰是蛋白质生物制药化学应用中使用广泛的技术，其中活化的聚乙二醇（PEG）聚合物共价连接到蛋白质上。生物缀合反应通常发生在亲核氨基酸残基（如伯胺和硫醇）与连接到 PEG（即活化）聚合物上的官能团（如 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯或马来酰亚胺）之间 [1]。由此产生的 PEG-蛋白质缀合物具有与未修饰的亲本蛋白质不同的物理化学和生理特性 [2]。这些修饰通常改善药代动力学和药效动力学性能；例如，PEG 的添加增加了分子量和流体力学半径，从而减少肾脏清除并延长循环半衰期，最终减少给药频率并提高生物利用度 [3,4]。由于这些优势，过去三十年中，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准了 25 多种 PEG 修饰生物制药蛋白用于治疗广泛疾病 [5,6]。PEG 修饰产品的商业成功继续推动市场增长，预计在整个 2020 年代将超过 9% 的年增长率，并在 2030 年达到约 35.5 亿美元 [7,8]。

在 PEG 修饰技术中，随机 PEG 修饰是最早的，由于蛋白质表面赖氨酸残基的高丰度，为生物缀合提供了有吸引力的附着位点，因此仍然被广泛使用 [9]。这种方法已使几种 FDA 批准的产品成为可能，并展示了强大的临床成功 [10]。蛋白质 PEG 修饰反应通常在混合良好的液相批次反应器中进行，其中蛋白质与活化的 PEG 聚合物反应 [11]。然而，由于大量的赖氨酸残基和 PEG 物种的反应性，延长的反应时间会导致 PEG 修饰物种的分布。会出现一个平行 - 连续反应网络，其中单 -PEG 修饰中间体可以进一步 PEG 修饰以产生二、三和更高阶的缀合物 [12,13]。此外，已知 NHS 活化的 PEG 聚合物在水性条件下容易水解，为大局增加了进一步的复杂性层 [14]。为了补偿水解并保持反应驱动力，通常使用摩尔过量的 NHS 活化 PEG 聚合物，这增加了不需要的多-PEG 修饰物种的形成。因此，经常出现产率 - 转化率权衡，其中更高的蛋白质转化率是以更低的单-PEG 修饰产物产率为代价实现的，从而降低选择性并限制整体生产力 [11,15]。

人们探索了替代的反应器配置以减轻这些局限性。一种方法涉及在合适的色谱树脂上进行 PEG 修饰反应，将反应和分离整合在单一步骤中 [16]。虽然这种策略可以通过空间位阻和降低位点可及性来限制多-PEG 修饰产物的形成，但该过程是扩散限制的而不是反应限制的，导致较低的转化率和有限的生产力。此外，柱内 PEG 修饰通常需要相对于批次操作大幅更高的 PEG 当量来补偿孔扩散限制，从而降低效率 [17]。相比之下，限制反应期间的 PEG 可用性已被证明能够在不影响转化率或单-PEG 修饰产物生产力的情况下控制 PEG 修饰度 [18]。

半间歇操作提供了实施受控 PEG 限制策略的有效平台。通过调节 PEG 进料速率，半间歇反应器可以在整个反应过程中保持最佳的 PEG:蛋白质摩尔比，从而最大化单-PEG 修饰产物的形成，同时抑制更高阶缀合物的形成。这种操作模式保留了反应控制的动力学，同时提高了选择性。然而，优化半间歇 PEG 修饰需要系统地评估多个相互作用的变量，包括 PEG 进料速率、PEG:蛋白质摩尔比和反应时间。一次改变一个因素的方法不足以理解这种相互作用，并可能导致关于最佳操作条件的误导性结论 [19,20]。相比之下，多因素实验设计能够高效地探索设计空间，在减少实验工作的同时提供对过程行为的全面洞察 [21,22]。统计分析通过识别显著因素和相互作用，并支持开发用于过程优化的预测模型，进一步增强了理解 [23,24]。例如，多元方差分析是理解多个变量及其相互作用如何影响复杂化学过程结果的重要统计工具 [25]。此外，PCA 是用于将相关变量转换为正交主成分的统计多维降维工具，这使得能够可视化主导趋势，同时保留数据集中的大部分方差 [26,27]。此外，聚类技术通常与 PCA 结合使用，将观察值划分为具有相似特征的组 [28]。

尽管有这些优势，文献中关于半间歇 PEG 修饰的严格统计分析和设计表征仍然有限。关于半间歇位点特异性 PEG 修饰的最近工作表明，与批次对照运行相比，在给定通量下减少所需 PEG 聚合物当量的潜力 [29]。其他关于蛋白质 PEG 修饰的研究侧重于优化容积活性或产物摩尔分数等参数 [30]，或开发详细动力学模型而未解决多目标权衡 [31]。虽然这些研究推进了对 PEG 修饰化学的理解，但仍缺乏结合设计空间映射、情景评估和稳健评估的综合多元统计分析。此类研究对于过程强化至关重要，过程强化旨在提高生产力、选择性和产率等关键绩效指标 [32,33]。通常认为两倍或更大的改善是成功的过程强化尝试的指示 [34,35]。

在本调查中，我们将之前的方法扩展到涉及连续和并行 PEG 修饰途径的更通用反应方案 [29]。我们在更复杂的反应网络中，在等效 PEG:蛋白质摩尔比下，评估了相对于批次对照运行的生产力、产率和选择性改进。目前的工作通过应用系统多因素操作条件设计和统计分析框架来解决半间歇随机 PEG 修饰过程的关键空白，提供对过程行为的基本见解，并实现增强的过程强化。

章节摘要

实验

溶菌酶 PEG 修饰实验是使用鸡蛋白溶菌酶和甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯（mPEG–SPA, 5 kDa）进行的。反应遵循类似于 Pfister 等人 [36] 报道的程序进行。实验在混合良好的批次反应器中使用 25 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）在 25 °C 和 300 RPM 下完成。溶菌酶制备初始浓度为 8 mg·mL?1，并在反应开始时加入 mPEG–SPA 以达到

数学建模与性能指标

溶菌酶 PEG 修饰使用基于天然蛋白质 (P₀) 和反应性 PEG–NHS 之间顺序反应的机理动力学框架描述，形成逐渐 PEG 修饰的物种 (P_i)。反应网络建模高达最大 PEG 修饰度六。完整的反应方案和控制方程在 SI 中提供（方程式 S1-S7）。

PEG 水解动力学是通过测量无蛋白质 PEG-NHS 在缓冲液中水解时 260 nm 处的 NHS 吸光度随时间变化估算的。批次反应器

溶菌酶 PEG 修饰的动力学分析

本研究调查了半间歇反应器操作在相对于传统批次处理提高随机蛋白质 PEG 修饰性能方面的潜力。显示半间歇和批次对照中输入过程变量的总体工作流程如图 1 所示。

为了确保可靠的动力学参数识别，通过测量 260 nm 处 UV 的增加来监测无蛋白质中 PEG-NHS 的失活。图 1A 显示失活模型与实验数据完美匹配 (R² =

结论

本研究证明了半间歇反应器操作在相对于传统批次处理显著改善 PEG 修饰工艺性能方面的潜力。通过系统筛选关键操作变量，构建并分析了包含 144 个半间歇案例的综合性能图谱。在所有调查变量中，排出比和循环时间显现为影响选择性和生产力的最重要因素，而总比率显示

资金

作者未获得该文章研究、撰写和/或发表的财务支持。

数据声明

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