奈拉替尼在硼掺杂金刚石电极上的电化学行为：Tween 20在界面信号增强中的作用

《ACS Omega》：Electrochemical Behavior of Neratinib at a Boron-Doped Diamond Electrode: Role of Tween 20 in Interfacial Signal Enhancement

　　

奈拉替尼（NER）是一种不可逆酪氨酸激酶抑制剂，用于HER2阳性乳腺癌的治疗。本研究考察了NER在硼掺杂金刚石电极（BDDE）上的电化学氧化行为，重点关注表面活性剂介导的界面影响。采用循环伏安法和微分脉冲伏安法表征了NER的氧化行为，并建立了其测定分析方法。在所考察的阴离子、阳离子和非离子表面活性剂中，Tween 20产生了最合适的电化学响应，显著增强了阳极峰电流并改善了信号稳定性。电化学阻抗谱（EIS）进一步表明，Tween 20显著改变了电解液/BDDE界面，使铁氰化/亚铁氰化氧化还原探针的电荷转移电阻从510 Ω增加至1822 Ω。重要的是，这一界面电阻的增加与NER伏安响应的增强同时发生，表明Tween 20并非通过非特异性加速电子转移动力学发挥作用。相反，所观察到的信号增强与NER-表面活性剂之间的正向相互作用以及有利于NER电化学可及性的修饰界面微环境相一致。扫描速率和pH依赖性研究表明，NER经历一个不可逆的、主要以扩散控制为主的氧化过程，涉及质子耦合电子转移。在含100 μM Tween 20的pH 7.02优化实验条件下，DPV信号在0.03–1.50 μM（16.7–836 ng mL^–1）浓度范围内与NER浓度呈线性关系。检测限和定量限分别为5.09 nM（2.84 ng mL^–1）和15.16 nM（8.44 ng mL^–1）。总体而言，研究结果表明，NER在BDDE上的分析信号增强源于表面活性剂介导的、分析物特异性的界面效应，并为其灵敏的伏安测定提供了机理基础。

**论文解读：奈拉替尼在硼掺杂金刚石电极上的电化学氧化行为及Tween 20界面信号增强机制研究**

**一、研究背景与目的**

乳腺癌是全球女性死亡的主要病因之一，位居世界第二大常见恶性肿瘤。2020年WHO数据显示，全球乳腺癌死亡人数约为685,000例。人表皮生长因子受体2（ErbB2/HER2）被认为是不可或缺的治疗靶点，约三分之一的乳腺癌病例中检测到HER2高水平表达，这与肿瘤侵袭性增强和临床预后不良密切相关。奈拉替尼（NER）是一种口服小分子酪氨酸激酶抑制剂，通过不可逆抑制其靶受体作用于多种HER变体，临床上作为曲妥珠单抗辅助治疗后早期HER2阳性乳腺癌患者的延长辅助单药治疗药物，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市。目前NER的常用测定方法主要包括超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）和荧光分光光度法。然而，色谱技术通常操作复杂，需要多步样品前处理，增加工作量和分析时间，且设备昂贵、需要专业人员操作，难以小型化。此外，暴露水平的微小偏差可能对治疗效果产生负面影响或增加副作用风险。因此，需要开发可靠、灵敏的分析方法，特别是在与药代动力学监测相关的低浓度水平下实现抗癌药物的精确测定。电分析方法具有快速、成本低、样品前处理需求少的实际优势。硼掺杂金刚石电极（BDDE）自1992年问世以来，因其宽电位窗口、高析气和碳腐蚀过电位、低背景电流和化学耐久性等独特性能，被广泛应用于电化学分析领域。将表面活性剂直接加入支持电解质中，是一种无需持久电极修饰即可调控电化学响应的策略。然而，关于表面活性剂分子如何影响NER在BDDE表面的电化学氧化行为，尤其是表面活性剂诱导的界面变化与NER伏安响应之间的关系，目前仍缺乏研究。本研究首次在未修饰BDDE上系统考察了NER的电化学行为，并探究表面活性剂种类对其伏安行为的影响，旨在阐明表面活性剂介导的界面效应机制并优化NER的电化学测定方法。

**二、主要技术方法**

研究人员采用循环伏安法（CV）和微分脉冲伏安法（DPV）表征NER的氧化行为并建立分析方法，使用电化学阻抗谱（EIS）评估表面活性剂引起的BDDE/电解液界面变化，采用扫描速率和pH依赖性研究阐明电极过程动力学特征，通过半经验PM6哈密顿量的量子化学计算辅助解析氧化机理。实验使用三电极体系，以直径3 mm的BDDE为工作电极、Ag/AgCl（3 M KCl）为参比电极、铂丝为对电极。商业人血清样本购自Sigma-Aldrich，储存于253 K，分析前恢复至298 K。表面活性剂选用阴离子型十二烷基硫酸钠（SDS）、阳离子型十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和非离子型Tween 20。

**三、研究结果**

**3.1 不同电解质和pH条件下NER的电化学行为**
研究人员通过DPV在pH 2.0–12.0范围内考察了NER在不同支持电解质中的氧化行为。结果表明，在pH 2.0和12.0时未观察到氧化峰，可能归因于强酸和强碱条件下的分析物降解。在pH 3.0–11.0范围内，BRB介质中NER氧化峰电位随pH升高而负移，该依赖关系在约pH 9.0处分界：pH 3.0–9.0区间斜率为?66.6 mV/pH，接近理论能斯特值59.2 mV/pH，表明氧化过程中质子与电子的化学计量比约为1:1；pH 9.0–11.0区间斜率仅为?2.2 mV/pH，这一转折点与NER的解离常数（pKa = 8.81）接近。通过ΔEp = Ep – Ep/2分析，取不可逆电极过程的电子转移系数α为0.5，计算得到电子转移数n约为1.14，取整为1，表明NER在BDDE上的氧化为单电子转移过程。比较不同缓冲体系后，虽然pH 6.02 PBS中峰电流最高，但重复性差；pH 7.02 PBS虽峰电流略低，但表现出优异的重复性、稳定性和明确的峰形，故选择0.1 M PBS（pH 7.02）为最佳支持电解质。

**3.2 表面活性剂对NER响应的调控**
研究人员考察了CTAB、SDS和Tween 20三种表面活性剂对NER电氧化行为的影响。无表面活性剂时，NER在pH 7.02 PBS中呈现明确且可重复的阳极峰（RSD≈1.30%）。加入50 μM CTAB后，峰电位正移、峰电流适度降低且RSD升高至约2.65%，归因于CTAB正电荷头基与部分质子化NER分子间的静电排斥以及在BDDE表面形成阻碍NER接近的正电荷界面层。加入50 μM SDS后峰电流显著降低但信号重复性好（RSD≈1.29%），因SDS负电荷硫酸根头基与NER质子化位点发生静电相互作用，促进分析物部分掺入界面结构，降低了自由扩散的电活性NER浓度。Tween 20的影响呈明显浓度依赖性：10和50 μM时峰电流较高但重复性差（RSD≈3.29–3.40%）；100 μM时NER阳极电流显著放大，与Tween 20胶束组装体对目标分析物的掺入和增溶作用有关；500 μM时电分析性能下降，可能因过量胶束覆盖电极/溶液界面阻碍电子传递。基于优化结果，选择100 μM Tween 20（高于其临界胶束浓度CMC = 60 μM）进行后续实验。Tween 20通过疏水区域与电极表面疏水域选择性相互作用，亲水性聚氧乙烯链延伸至水相，形成有利于NER分子在电极表面局部积累和稳定的界面微环境。

**3.3 电化学阻抗谱界面表征**
研究人员以铁氰化/亚铁氰化氧化还原对为电化学探针进行EIS测量。加入Tween 20后，Nyquist半圆显著增大，界面电荷转移电阻（Rct）从无表面活性剂缓冲液中的510 Ω增至含Tween 20介质中的1822 Ω，增加超过三倍，表明Tween 20修饰了电极-电解液界面并通过形成部分阻塞的界面层阻碍了探针的电子传递。此外，含Tween 20时阻抗信号偏离理想半圆形状，表明出现了额外的界面过程和更不均匀的电极/电解液界面。EIS中Rct的增大与DPV中NER氧化信号的增强并不矛盾，因EIS实验使用铁氰化/亚铁氰化探针反映探针物种的电子转移动力学，而NER的伏安响应反映分析物自身的氧化行为，增强可归因于Tween 20诱导的有利分析物-表面活性剂相互作用和界面微环境变化。

**3.4 电化学动力学与传质特性**
扫描速率依赖性CV研究在10–1000 mV s^–1范围内进行。空白电解质在考察电位窗口内无法拉第信号，加入0.50 μM NER后在约+0.81 V（vs Ag/AgCl）处出现明显阳极信号，反向扫描无相应还原峰，表明NER在BDDE上的电化学氧化为不可逆过程。log Ip–log v关系斜率为0.5898，接近理论扩散控制值0.5；阳极峰电流与扫描速率平方根（v^1/2）呈良好线性关系（R² = 0.9813），证实NER氧化过程以扩散控制为主，表面吸附贡献相对较小。

**3.5 电氧化机理的提出**
基于不可逆伏安行为、pH依赖性电位位移和单电子转移的评估结果，研究提出NER在BDDE上的氧化涉及约一个电子和一个质子的质子耦合氧化途径。NER的芳香骨架含有给电子的芳基醚和烷氧基部分（吡啶基甲氧基和乙氧基取代基），这些基团使π体系电子密度增加，有利于阳极电子移除和随后的自由基阳离子中间体形成。参考甲氧基苯和二烷氧基苯阳极氧化的既有研究（如坦索罗辛、福莫特罗等含烷氧基苯片段药物的电氧化行为），提出了涉及烷氧基苯部分的氧化途径，但该机理应视为一种解释而非氧化位点的确定性证明。

**3.6 氧化途径的计算化学支持**
采用半经验PM6哈密顿量在单重态下对NER进行电子特性计算。经基态几何优化后，计算了总能量和前沿分子轨道能量及相应化学描述符。最高占据分子轨道（HOMO）图显示共轭芳香体系和含杂原子部分具有显著轨道密度，表明这些区域优先参与电化学氧化过程中的供电子行为。最低未占分子轨道（LUMO）位于相邻π共轭域，表明电子转移后可能发生电荷重新分布。计算得到E_LUMO = ?0.03939 au、E_HOMO = ?0.32812 au，能隙ΔE_Gap = 0.28873 au（对应7.86 eV），反映了相对较小的前沿轨道分离，与可参与电子转移过程的分子特征相符。

**3.7 分析性能验证**
在最优实验条件（0.1 M PBS pH 7.02，含100 μM Tween 20）下，DPV信号在0.03–1.50 μM浓度范围内与NER浓度呈线性关系，回归方程为y (μA) = 0.3243(NER, μM) – 0.0107，R² = 0.9931。按信噪比（S/N）为3和10的标准，检测限（LOD）为5.09 nM（2.84 ng mL^–1），定量限（LOQ）为15.16 nM（8.44 ng mL^–1）。与文献报道的HPLC法（LOD = 448.0 ng mL^–1）相比，所提出的DPV方法检测限提高约158倍，也优于部分UPLC-MS/MS方法（4.0 ng mL^–1），表明该方法不仅更简单、成本更低，而且对NER痕量测定具有高灵敏度。

**3.8 人血清中NER测定的分析评价**
在优化实验条件下于商业人血清中构建了基于基质的独立校正曲线。NER在血清中的线性范围为0.05–1.50 μM，回归方程为y (μA) = 0.4124(NER, μM) – 0.0174，R² = 0.9966。血清中LOD和LOQ分别为2.27 nM和6.87 nM。采用标准加入法对加标0.2 μM NER的血清样本进行五次平行测定，回收率为99.98 ± 2.79%，确证了该方法在实际生物样本中的准确性和适用性。

**3.9 干扰研究**
选择性评估选取了NaCl、KCl、咖啡因、葡萄糖和抗坏血酸作为潜在干扰物。在0.5 μM NER存在下，以干扰物浓度比1:1、1:10和1:100进行测定。结果显示RSD范围为0.99%–5.72%，回收率在97.01%–108.83%之间，即使干扰物浓度达到NER的100倍，所有测试物种均未对NER测定产生显著干扰，表明BDDE传感器具有高选择性。

**3.10 方法绿色度评估**
采用AGREE、AGREEprep和ComplexMoGAPI三种绿色分析化学评价工具评估方法的环境可持续性。AGREE评分为0.60，表明符合绿色分析化学原则，具有低能耗、无衍生化、快速电化学检测和低样品试剂消耗等优点，但离线分析配置、血清样品制备和蛋白沉淀中乙腈的使用影响了总分。AGREEprep评分为0.62，显示样品前处理程序的可持续性水平令人满意。ComplexMoGAPI总分为82/100，表明方法具有良好的整体绿色度，主要限制因素为乙腈的使用和离线样品前处理程序。

**四、总结与结论**

该研究首次系统考察了NER在未修饰BDDE上的电化学行为，并首次评估了表面活性剂介导对其伏安响应的影响。电化学结果证明NER经历不可逆且以扩散控制为主的氧化过程，涉及约一个电子和一个质子。pH依赖性行为、扫描速率研究和计算分析共同支持了所提出的质子耦合电氧化途径。在所考察的表面活性剂中，非离子型Tween 20对NER响应产生最有利的影响，最佳浓度为100 μM。EIS测量显示加入Tween 20后铁氰化/亚铁氰化探针的电荷转移电阻从510 Ω增至1822 Ω，尽管NER氧化电流增强，表明Tween 20并非简单地加速BDDE上的电子转移，而是通过表面活性剂诱导的电解液/BDDE微环境组织化，产生分析物依赖性的界面效应，有利于NER的电化学响应。在0.1 M PBS（pH 7.02）含100 μM Tween 20的优化条件下，DPV方法提供0.03–1.50 μM的线性响应，LOD为5.09 nM，LOQ为15.16 nM。该方法在商业人血清中线性范围为0.05–1.50 μM，回收率为99.98 ± 2.79%，常见潜在干扰物对NER测定无显著影响。该方法无需持久修饰BDDE、纳米材料涂层或生物识别元件，降低了电极制备要求并简化了分析流程。该研究发表在《ACS Omega》。总体而言，未修饰BDDE/Tween 20体系被确认为一种选择性、灵敏且相对简单的NER测定平台，同时为表面活性剂介导的界面组织如何引导NER伏安响应提供了新的机理见解。