玉米芯和木屑反硝化生物反应器在连续水力运行阶段下的微生物群落与硝酸盐去除趋势

《ACS ES&T Water》：Microbial Community and Nitrate Removal Trends in Corncob and Woodchip Denitrifying Bioreactors under Sequential Hydraulic Operating Phases

　　

反硝化生物反应器依赖碳介质支持微生物群落，这些微生物从地下排水水中去除硝酸盐。木屑（WCs）和玉米芯（CCs）是常用的介质，但其相关的微生物群落仍缺乏比较。研究人员评估了六个含有WC或CC介质的实验室规模上流式生物反应器中的硝酸盐去除效率（NRE）和基于16S rRNA基因的微生物群落组成。生物反应器以8、16和4 h的水力停留时间顺序运行，以评估不同运行条件下的性能和群落响应。在8 h和16 h阶段，CC生物反应器比WC生物反应器实现了更高的NRE，而在4 h阶段未观察到显著差异。微生物群落在介质类型之间存在差异，并随运行阶段发生改变，反映了底物特性、介质更换、水力条件和反应器历史的综合影响。尽管WC系统支持更高的分类学丰富度，但这种多样性与较高的NRE无关。相反，CC系统在介质富集类群与NRE之间表现出更强的关系。这些结果表明，与底物相关的微生物群落组成与硝酸盐去除性能相关，在评估反硝化生物反应器时应与水力运行和反应器历史一同考虑。

论文解读：玉米芯与木屑反硝化生物反应器中的微生物群落与硝酸盐去除趋势

**研究背景与目的**

美国中西部农业生产高度依赖地下暗管排水和高氮肥投入，这导致硝酸盐绕过自然反硝化区，大量进入密西西比河流域，进而引发墨西哥湾水体缺氧等生态环境问题。反硝化生物反应器作为田边处理系统，通过将暗管排水引入富含碳介质的反应器，利用微生物反硝化作用将硝酸盐（NO₃^–）逐步还原为亚硝酸盐（NO₂^–）、一氧化氮、氧化亚氮（N₂O）最终至氮气（N₂）。木屑（WC）和玉米芯（CC）是常用的碳介质，但二者的微生物群落比较研究仍然匮乏。已有研究多聚焦于木屑反应器中的反硝化菌群或功能基因，对整体微生物群落结构随碳介质和水力条件变化的响应认识不足。为此，研究人员在实验室规模上构建了上流式反硝化生物反应器，比较木屑和玉米芯介质在连续多个水力停留时间（HRT）阶段下的硝酸盐去除性能与16S rRNA基因微生物群落组成，旨在揭示碳介质相关微生物群落与脱氮性能的关联。

**主要技术方法**

研究人员构建了6个实验室规模上流式柱状生物反应器，其中3个填充混合硬木片（Golden Valley Hardscapes，爱荷华州Story City），3个填充玉米芯段（爱荷华州立大学BioCentury Research Farm）。反应器使用来自Blackhawk Lake流域（42.2611°N, 95.0556°W，26 mg N/L）的暗管排水接种，并以含30 mg/L硝酸盐的合成营养液连续供给。生物反应器依次在8、16、4 h的HRT下运行。水样分析采用SEAL Analytical EPA-114A法测定硝酸盐+亚硝酸盐浓度，Shimadzu TOC-L分析仪测定总有机碳（TOC），气相色谱电子捕获检测器测定溶解性N₂O，EPA-103-A法测定氨氮。微生物样品提取DNA后扩增16S rRNA基因V4区，在Illumina MiSeq平台测序，DADA2流程处理，Silva数据库进行ASV分类。统计方法包括非度量多维尺度分析（NMDS）、排列多元方差分析（PERMANOVA）、Wilcoxon秩和检验及Spearman相关分析。

**主要研究结果**

**3.1 硝酸盐去除效率**

通过每周及隔日采集进出水样品并计算NRE，研究发现CC反应器在8 h和16 h HRT阶段显著高于WC反应器，而4 h HRT阶段无显著差异。CC反应器平均NRE分别为57.45%±23.38%（8 h）、84.97%±17.13%（16 h）和13.30%±6.97%（4 h）；WC反应器相应为14.11%±4.86%、28.02%±7.68%和15.76%±10.75%。TOC浓度在CC中普遍高于WC，且随HRT阶段变化。NO₂^–、溶解性N₂O和NH₄⁺浓度整体较低，表明中间产物积累有限。

**3.2 跨介质类型和HRT相关操作阶段的微生物群落结构**

基于16S rRNA基因序列的NMDS分析显示，CC和WC微生物群落明显分离，并伴随HRT阶段出现聚集。PERMANOVA表明介质类型和HRT阶段均解释显著变异，其中介质类型贡献更大。WC介质中的特有ASV数量多于CC，且WC的Shannon、Chao1和Simpson多样性指数均高于CC。由于CC介质在实验中被更换，各HRT阶段在每种介质内单独解释。WC在8 h和16 h阶段群落相似，4 h阶段发生明显变化；CC在初始8 h阶段与后续阶段差异显著，与介质更换一致。Venn图显示CC和WC群落共有ASV重叠有限。

**3.3 介质富集ASV及其与硝酸盐去除效率的关联**

利用16 h HRT阶段样本进行差异丰度分析，共鉴定出317个显著富集的ASV（se-ASV），其中71个在CC中富集，246个在WC中富集。这些se-ASV在8 h和16 h阶段主要局限于各自介质，4 h阶段两类介质的se-ASV均大量出现。se-ASV的累积相对丰度与NRE呈正相关，且这种关联在CC中（r=0.79, p=1.40×10^–13）强于WC（r=0.33, p=0.02）。

**3.4 介质富集ASV的分类学背景**

门水平上，Pseudomonadota在两类介质的所有阶段中均为最优势门，且在16 h阶段相对丰度最高（CC 67.60%，WC 43.27%）。WC群落含有更多低丰度门类，如Halobacterota、Thermoplasmatota、Patescibacteria、Spirochaetota等，而CC中罕见。属水平上，CC的优势富集属较为固定，包括Xanthobacter、Pseudorhodoplanes、Pseudomonas、Azospira、Azotobacter和Cellulomonas；WC则包含更广泛且随阶段变化的富集属，如Afipia、Telmatospirillum，以及产甲烷相关古菌属。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，CC反应器较高的NRE与更高的TOC释放有关，但碳含量不能完全解释群落差异，碳介质可能通过提供不同的栖息环境和底物特性影响微生物群落结构。尽管WC系统具有更高的分类学丰富度，但丰富度与NRE无关，相反，介质富集ASV的相对丰度与NRE联系更紧密，尤其在CC中，提示功能微生物的富集程度而非简单多样性驱动脱氮性能。HRT阶段的顺序运行意味着结果反映了流态、反应器年龄、介质更换及停滞史的综合效应，而非独立HRT处理。NRE与硝酸盐质量去除描述不同方面，本实验负荷率和HRT共变，无法区分其各自贡献。此外，未连续监测氧化还原条件和溶解氧，未来需通过直接测量N₂产生、功能基因等明确氮转化路径。

研究结论：本研究表明在评估实验室规模反硝化生物反应器时，必须同时考虑碳介质、水力操作和反应器历史。CC反应器在较长滞留阶段通常比WC具有更高NRE，但WC支持更高的分类学丰富度，表明高微生物丰富度并不必然对应高NRE。相反，硝酸盐去除与介质富集ASV的相对丰度更密切相关，尤其在CC中。由于HRT顺序实施且CC介质在8 h阶段后被更换，结果应解释为系统水平响应。未来研究需采用更直接分离介质类型、HRT、反应器年龄和介质更换效应的设计，并结合碳化学、氧化还原条件、氮转化路径及硝酸盐负荷去除的测量，以明确碳介质和运行历史对田间条件下长期性能的影响。该研究发表在《ACS ES》，为优化生物反应器设计和运行提供了微生物学依据。