区分蛋白质胶体稳定性与热稳定性的必要性

《Nano Letters》：The Need to Distinguish Colloidal and Thermal Stability for Proteins

　　

蛋白质稳定性在药物制剂开发和理解蛋白质行为的许多方面至关重要。已知热稳定性和胶体稳定性均受到小分子存在的调节。由于热稳定性比胶体稳定性更容易评估，因此常被用作评估后者的替代指标。在本篇微型综述中，研究人员主张，尽管这两种稳定性应以某种复杂方式相关联，但仍必须将它们分开考虑。

蛋白质稳定性在生物技术和药物制剂领域具有核心重要性。然而，“蛋白质稳定性”一词常被宽泛甚至模糊地使用，涵盖耐热、耐冷、抗氧化、抗蛋白水解或化学降解以及胶体稳定性等不同性质。热稳定性指蛋白质在加热时保持天然折叠结构的能力，通常以熔解温度T_m表征；胶体稳定性则描述蛋白质在溶液中保持均匀分散、不发生自缔合、聚集、相分离等过程的趋势，通常通过第二渗透维里系数B₂₂衡量。由于热稳定性测量相对简便，T_m常被用作预测胶体稳定性的替代指标，但这一做法可能产生误导。已有研究表明，仅凭热解折叠参数不足以预测长期聚集或制剂稳定性。该论文发表在《Nano Letters》上，是一篇微型综述，旨在阐明热稳定性与胶体稳定性必须作为独立性质分别评估。

研究人员利用文献数据以及为本文新开展的测量，系统比较了多种小分子对溶菌酶和人碳酸酐酶（hCa）的ΔT_m与ΔB₂₂的影响。结果显示，小分子对这两种稳定性的影响并不一致。对于溶菌酶，四种象限均有数据点分布：多数氨基酸同时升高T_m和B₂₂；而1,1,1-三(羟甲基)乙烷（TME）、己二醇、尿素和盐酸胍（Gdn·HCl）在升高B₂₂的同时降低T_m；三甲胺N-氧化物（TMAO）则升高T_m但降低B₂₂。对于hCa，所有测试分子均升高B₂₂，但对T_m影响各异；脯氨酸在升高B₂₂的同时轻微降低T_m。这些结果说明热稳定性与天然态胶体稳定性之间不存在普遍关联。

**主要技术方法**：研究人员采用热位移分析（TSA）测定两种蛋白在不同溶液条件下的T_m，使用UNcle仪器（Unchained Laboratories）在295 nm激发，记录350/330 nm荧光比值；采用沉降平衡分析超速离心（AUC-SE）测定B₂₂，蛋白浓度为10 mg/mL，溶菌酶在36 krpm、hCa在25 krpm下达到沉降-扩散平衡。溶菌酶购自Roche（产品号10837059001），hCa购自Giotto Biotech（Firenze, Italy；产品号G07CA201）。部分B₂₂文献值来自自相互作用色谱（SIC）和静态光散射（SLS）等方法。

**蛋白质热稳定性及其测量方法**：热稳定性通过T_m量化，T_m是热解折叠转变的中点温度。测量方法包括微差示扫描量热法（μ-DSC）、基于蛋白内源荧光的T_m位移分析（TSA）、使用外源染料（如SYPRO Orange）的TSA变体，以及圆二色（CD）光谱法。μ-DSC提供直接热力学信息但通量较低；TSA和CD适用于不同场景的制剂筛选。

**蛋白质胶体稳定性及其测量方法**：胶体稳定性由蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的排斥与吸引平衡决定，可用第二渗透维里系数B₂₂描述。B₂₂可分解为硬球贡献和相互作用贡献，正值表示净排斥，负值表示净吸引。测量方法包括沉降平衡分析超速离心（AUC-SE）、静态光散射（SLS）、自相互作用色谱（SIC）、渗透压法以及冷冻电子断层扫描。不同技术得到的表观维里系数可能不等价，在含盐、缓冲液或赋形剂的多组分溶液中尤其需要谨慎解释。

**小分子对T_m和B₂₂的调节**：研究人员比较了多种小分子对溶菌酶和hCa的影响。结果分为四个象限：右上（两者均升）、右下（B₂₂升T_m降）、左下（两者均降）、左上（T_m升B₂₂降）。溶菌酶四个象限均有分布，hCa只有右侧。这表明小分子效应具有蛋白依赖性，热稳定性和胶体稳定性不应假定关联。

**讨论**：优先相互作用模型可解释部分现象，但不能解释所有观察，例如脯氨酸。金纳米颗粒实验表明TMAO和尿素对胶体稳定性的影响不能仅归因于蛋白折叠。研究人员提出了基于Langmuir吸附的理论框架，解释小分子通过阻断吸引性表面斑块升高B₂₂，但该框架目前只能解释稳定化效应。

**结论**：胶体稳定性与热稳定性应以非平凡方式关联，需更多研究理解其联系。在此之前，应将其视为独立现象，分别评估pH、离子强度和赋形剂等外部因素对两者的影响。