《Science Progress》：Involvement of NOD1/NF-κB/MAPK pathway in the protective effect of procyanidin B2 against methotrexate-induced nephrotoxicity
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摘要翻译
目的：甲氨蝶呤（MTX）是一种用于治疗类风湿关节炎和恶性疾病的高效药物。尽管其疗效显著，但长期使用MTX与多器官毒性相关，包括肾损伤。因此，有必要探索一种低副作用的肾脏保护剂。原花青素B2（PCB2）是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化和抗炎活性。本研
摘要翻译
目的：甲氨蝶呤（MTX）是一种用于治疗类风湿关节炎和恶性疾病的高效药物。尽管其疗效显著，但长期使用MTX与多器官毒性相关，包括肾损伤。因此，有必要探索一种低副作用的肾脏保护剂。原花青素B2（PCB2）是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化和抗炎活性。本研究旨在探讨PCB2对MTX诱导肾毒性的潜在保护作用。方法：将大鼠分为四组：对照组、PCB2组（40 mg/kg，口服）、MTX中毒组（20 mg/kg，腹腔注射）和PCB2+MTX组。PCB2连续给药十天，而MTX于第8天单次注射。采用生化、组织学和免疫组织化学方法评估肾组织中的氧化应激和炎症生物标志物。结果：MTX显著升高肾组织丙二醛（MDA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的水平，而谷胱甘肽（GSH）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性显著降低。此外，MTX中毒大鼠表现出核苷酸结合寡聚化结构域1（NOD1）、核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的阳性和强免疫反应。PCB2的给药显著预防了组织损伤并恢复改变的参数。结论：PCB2减轻了氧化应激和炎症反应，表明其对MTX诱导的肾损伤具有潜在保护作用。
论文解读文章
**研究背景与目的**
甲氨蝶呤（Methotrexate, MTX）是一种有效的二氢叶酸还原酶（Dihydrofolate reductase, DHFR）抑制剂，通过减少细胞内四氢叶酸（叶酸的活性形式）发挥药理作用，广泛用于类风湿关节炎和恶性疾病的治疗。尽管MTX疗效确切，但临床前及临床研究均报道，高剂量MTX与肾损伤密切相关。即使在密切监测血药浓度并采取不同预防措施的情况下，接受MTX治疗的患者中仍有1%~48%会出现剂量依赖性急性肾损伤。因此，MTX诱导的肾毒性成为限制其长期临床应用的主要障碍。MTX诱导肾毒性的确切机制尚未完全阐明，但可能与其代谢产物7-羟基MTX在肾小管中蓄积有关。此外，活性氧（Reactive oxygen species, ROS）的产生、炎症介质的释放以及细胞凋亡的启动也是MTX肾损伤的潜在机制。ROS可引发氧化应激，进而激活促炎通路，包括核因子-κB p65（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶P38（MAPK），二者是TNF-α和IL-6等炎性细胞因子释放的上游调节因子。此外，核苷酸结合寡聚化结构域1（NOD1）的激活可诱导炎症及应激级联反应，主要激活MAPK和NF-κB通路。因此，维持氧化还原和炎症过程的平衡对于应对MTX诱导的肾毒性至关重要。
原花青素B2（Procyanidin B2, PCB2）是从原花青素提取物中分离得到的天然黄酮类化合物，已被证明具有抗氧化、抗炎和抗凋亡活性。已有研究表明，PCB2可抑制NF-κB并预防氧化型低密度脂蛋白诱导的人内皮细胞损伤。此外，PCB2通过减少氧化应激和下调包括TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6在内的炎症介质，对MTX诱导的肝损伤表现出保护活性。然而，PCB2对MTX诱导肾损伤的保护作用及其分子机制尚未见报道。因此，本研究首次探讨了PCB2对MTX诱导大鼠肾损伤的保护作用，重点关注其抗氧化和抗炎效应，并从机制层面研究NOD1/NF-κB/MAPK通路在PCB2调节作用中的角色。
**研究方法概述**
本研究采用32只雄性成年Wistar白化大鼠（体重200~250 g），购自沙特阿拉伯利雅得国王大学药学院动物护理中心。实验方案经国王大学研究伦理委员会批准（伦理编号：KSU-SE-23-15），并遵循ARRIVE指南。大鼠随机分为四组（每组8只）：对照组（口服1%羧甲基纤维素）、PCB2对照组（40 mg/kg PCB2溶于1% CMC，口服，连续10天）、MTX组（第8天单次腹腔注射20 mg/kg MTX）、MTX+PCB2组（连续10天给予PCB2，第8天单次注射MTX）。第11天处死大鼠，收集血液和肾组织样本。主要检测方法包括：血清肌酐、尿酸和尿素水平的比色法测定；肾组织丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）水平的试剂盒检测；TNF-α和IL-6水平的ELISA检测；肾组织苏木精-伊红（H&E）染色组织病理学评估；NOD1、NF-κB和MAPK的免疫组织化学（IHC）分析。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后多重比较检验。
**研究结果**
**3.1 PCB2恢复血清肌酐、尿酸和尿素水平**
与对照组相比，MTX中毒大鼠血清肌酐、尿酸和尿素水平显著升高（p < 0.0001，η2分别为0.6797、0.7768和0.8063）。而PCB2治疗显著恢复了这些指标的水平，表明PCB2改善了MTX引起的肾功能损害。
**3.2 PCB2减轻肾组织氧化应激**
MTX处理导致肾组织MDA水平显著升高（p < 0.0001，η2=0.8656），同时GSH水平和SOD活性显著降低（p < 0.0001，η2分别为0.7936和0.8910）。PCB2干预显著降低了MDA水平（p < 0.0001），并显著恢复GSH水平（p < 0.01）和SOD活性（p < 0.0001），表明PCB2通过增强内源性抗氧化防御系统减轻MTX诱导的氧化应激。
**3.3 PCB2下调肾组织TNF-α和IL-6表达水平**
MTX中毒组促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达水平较对照组显著升高（p < 0.0001，η2分别为0.9532和0.9465）。PCB2给药导致TNF-α和IL-6水平较MTX中毒组显著降低（p < 0.0001），证实了PCB2的抗炎作用。
**3.4 PCB2改善MTX诱导的肾组织形态学改变**
对照和PCB2处理大鼠的肾组织切片显示正常的肾小管和肾小体。MTX给药大鼠的肾组织切片显示肾小体退化、肾小球完全破坏。然而，PCB2治疗改善了MTX过量引起的组织病理学变化并恢复了正常结构。定量分析显示，MTX中毒组损伤肾小球百分比显著增加（p < 0.0001），而MTX+PCB2组较MTX组显著减少（p < 0.0001），表明PCB2对肾组织结构具有显著保护作用。
**3.5 PCB2降低MTX诱导的肾组织NOD1、NF-κB和MAPK阳性免疫反应**
免疫组织化学分析显示，对照组和PCB2处理组肾小球和肾小管上皮中NOD1呈轻度免疫反应。MTX暴露大鼠肾组织表现出肾小球上皮和大部分肾小管上皮的NOD1强免疫反应性。MTX+PCB2联合治疗组肾小管和肾小球中NOD1免疫反应减弱。类似地，MTX诱导了肾小体上皮、大部分肾小管及间质细胞NF-κB的强阳性免疫反应，而PCB2治疗组表现为中度免疫反应。此外，MTX组p38MAPK在肾小体上皮和大部分肾小管中呈强免疫阳性，PCB2治疗组表现为中度免疫反应。这些结果表明PCB2通过抑制NOD1/NF-κB/MAPK通路的激活发挥抗炎保护作用。
**讨论与结论**
本研究证实PCB2通过调节氧化应激、炎症反应及NOD1/NF-κB/MAPK通路减轻MTX诱导的肾毒性。研究结果显示，MTX单次腹腔注射（20 mg/kg）显著升高了尿酸、肌酐和尿素等肾毒性标志物，同时增加了MDA水平、耗竭GSH和SOD，并升高TNF-α和IL-6水平。PCB2治疗有效逆转了上述改变。组织学分析显示MTX导致肾小体退化和肾小球破坏，而PCB2治疗有效改善。此外，MTX增加了肾脏NF-κB、MAPK和NOD1的蛋白表达，PCB2给药则降低了这些蛋白的激活。
MTX诱导氧化应激的机制涉及多条生化通路：抑制NADP依赖性脱氢酶和NADP苹果酸酶，减少NADPH产生继而损害GSH再生；抑制二氢叶酸还原酶促进一氧化氮合酶解偶联导致超氧化物生成；增加黄嘌呤氧化酶活性进一步增强ROS产生。PCB2的抗氧化活性通过直接清除ROS和增强内源抗氧化系统实现，包括促进核因子E2相关因子2（Nrf2）的核转位，上调抗氧化酶如氧合酶-1和NADPH醌氧化还原酶1的合成。
在抗炎方面，PCB2通过抑制TLR4/NF-κB信号通路降低TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症介质的产生。本研究中PCB2降低NOD1、NF-κB和MAPK免疫反应性的结果进一步证实了其抗炎活性。NOD1作为胞质模式识别受体，感知细胞应激并启动炎症反应，激活的NOD1上调NF-κB和MAPK下游通路，进而诱导TNF-α和IL-6等促炎细胞因子的分泌。NF-κB和MAPK通路的激活还可促进肾损伤中的细胞凋亡、纤维化和免疫细胞浸润。
研究存在以下局限性：样本量较小可能限制结果的普适性；使用单次MTX剂量可能不能反映临床用药情况；10天的短期研究不能反映MTX长期效应及PCB2的长期保护作用；未来需要采用RT-PCR、Western blotting或磷酸化检测等分子技术进一步确证NOD1/NF-κB/MAPK通路参与的机制。
研究结论指出，MTX通过诱导氧化应激和炎症反应导致大鼠肾毒性，PCB2通过平衡氧化还原反应和调节NOD1/NF-κB/MAPK轴减轻肾毒性。这些发现凸显了PCB2作为MTX诱导肾毒性辅助治疗策略的潜在价值。然而，当前研究结果仍需进一步研究以确定人体剂量、深入分子机制、药代动力学特征、安全性及其临床结局。
