补肾固冲汤通过上调 GPX4 抑制滋养细胞铁死亡从而缓解不明原因复发性流产

《Science of Traditional Chinese Medicine》：Bushen Guchong Decoction alleviates URSA by inhibiting trophoblast ferroptosis via upregulation of GPX4

　　

背景：不明原因复发性自然流产 (URSA) 是一种主要的生殖健康疾病，会对女性的身心健康产生不利影响，突显了对有效治疗策略的迫切需求。新兴证据表明，滋养层细胞铁死亡参与了 URSA 的发病机制；然而，其潜在机制尚不清楚。补肾固冲汤 (BSGCD) 是一种经典的传统中药方剂，已广泛用于 URSA 的临床管理。然而，其治疗作用背后的精确分子和细胞机制尚未完全阐明。目的：调查 BSGCD 是否通过增强滋养层细胞中介于谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 的铁死亡抵抗力来缓解 URSA。方法：进行 RNA 测序以识别 URSA 患者和正常孕妇绒毛组织中差异表达的基因。测定绒毛组织中丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽 (GSH) 和亚铁离子 (Fe2+) 的水平，并通过 Western 印迹分析关键铁死亡相关蛋白的表达。将 30 只小鼠随机分为 6 组（每组 n = 5）。从 E0.5 开始，URSA 模型小鼠每日给予不同剂量的 BSGCD 或阳性对照药地屈孕酮 (DYG)。在 E12.5 处死小鼠，并评估妊娠结局以及胎盘铁死亡标志物。评估 BSGCD 对体内胚胎吸收、胎儿和胎盘发育以及胎盘铁死亡的影响。采用超高效液相色谱 - 串联质谱 (UHPLC–MS/MS) 鉴定 BSGCD 的生物活性成分，随后进行网络药理学分析以探讨其对 URSA 治疗作用的分子机制。建立 GPX4 敲低 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞模型以评估 BSGCD 对体外铁死亡的影响。进行分子对接、表面等离子体共振和细胞热位移分析 (CETSA) 以验证 BSGCD 关键生物活性成分与 GPX4 之间的相互作用。结果：与正常妊娠对照组相比，URSA 患者的绒毛组织表现出增强的铁死亡，特征为 MDA 和 Fe2+ 水平升高，GSH 含量下降，GPX4 表达减少 (P < 0.05, P < 0.01)。在小鼠 URSA 模型中，BSGCD 治疗降低了胚胎吸收率并改善了胎儿和胎盘发育，伴有胎盘铁死亡的减轻 (P < 0.05, P < 0.01)。在机制上，BSGCD 通过稳定 GPX4 蛋白发挥其保护作用 (P < 0.05, P < 0.01)。网络药理学分析与表面等离子体共振和 CETSA 验证相结合表明，甘草酸 A 和黄芩苷是 BSGCD 的关键生物活性成分，它们与 GPX4 相互作用并协同抑制铁死亡。结论：BSGCD 通过稳定 GPX4 抑制滋养层细胞铁死亡，从而对 URSA 发挥保护作用。甘草酸 A 和黄芩苷是这些治疗效果的关键贡献者。1. 引言
复发性自然流产 (RSA) 是一种复杂的妊娠疾病，定义为妊娠 20 周前连续丢失两次或更多次妊娠。[1] 虽然染色体异常、内分泌障碍、解剖缺陷和感染是 RSA 的已知原因，但约 50% 的病例仍无法解释，被分类为不明原因复发性自然流产 (URSA)。[2,3] URSA 给女性的生殖健康和心理健康带来了巨大负担；然而，其病因复杂且仍未完全理解。目前 URSA 的治疗策略有限，临床结果往往不尽如人意。[4] 现代医学中复发性流产的标准治疗主要包括免疫疗法和激素疗法。然而，这些方法存在显著局限性，包括长期使用激素相关的血栓形成和内分泌障碍风险增加，以及免疫疗法成本高且个体疗效差异大。[5] 因此，迫切需要更安全有效的 URSA 治疗策略。
胎盘在维持妊娠和支持胎儿生长方面发挥着至关重要的作用。成功的胎盘发育和功能很大程度上取决于滋养层细胞，其增殖、分化和侵袭对于建立母胎营养交换和确保胎儿正常发育至关重要。适度的氧化应激作为促进细胞增殖和血管生成的重要信号刺激。相反，过度的氧化应激会破坏胎盘稳态，并被认为与多种妊娠相关并发症有关。铁死亡是一种由细胞内铁过载和抗氧化防御受损引起的铁依赖性脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式。[6,7] 新兴证据表明，铁死亡通过异常的胎盘重塑导致妊娠期高血压疾病，通过失调的铁代谢导致妊娠期糖尿病等妊娠相关疾病的发病机制。[7–11] GPX4 在此过程中发挥核心作用，作为一种关键的谷胱甘肽 (GSH) 依赖性酶，负责清除脂质过氧化物。GPX4 的基因剔除会导致早期胚胎致死，突显了其在胎盘功能和抵抗铁死亡中的关键作用。[12,13] 然而，尽管抗氧化能力受损和铁死亡已被认为与 URSA 有关，但该条件下 GPX4 介导的铁死亡背后的调节机制仍知之甚少。
从传统中医 (TCM) 理论的角度来看，生殖功能与肾系统密切相关，流产通常归因于肾虚和冲任二脉功能失调。[14] 旨在补肾和调节冲任二脉的治疗策略已在临床实践中使用了几个世纪，报告了临床益处和良好的安全性概况。然而，这些治疗作用背后的生物学基础尚未完全阐明，这限制了它们在当代医学实践中的更广泛接受和整合。正如尚洪才教授所强调的，中医药的现代化不仅需要积累临床经验，还需要对其机制进行系统的科学阐明。[15] 因此，阐明 URSA 的病理生理机制和中医药干预的分子机制可能为改善临床管理和推进草药现代化提供重要见解。
补肾固冲汤 (BSGCD) 是一种基于“肾主生殖”原则开发的经典中医方剂。它已广泛用于 URSA 的临床管理，在降低流产率和支持妊娠结局方面显示出有益效果。[16] 然而，其治疗作用是否涉及调节胎盘氧化应激和铁死亡仍不清楚。在本研究中，我们系统地调查了滋养层细胞铁死亡在 URSA 发病机制中的作用，并评估了 BSGCD 的保护机制。我们提出 BSGCD 通过稳定 GPX4 抑制滋养层细胞铁死亡来缓解 URSA，由其关键生物活性成分黄芩苷和甘草酸 A 协同介导。这些发现不仅阐明了这种经典中医方剂发挥保护作用的新型机制，还强调了 GPX4 稳定作为 URSA 的潜在治疗策略。2. 材料与方法
2.1. 临床样本收集
本研究经山东妇幼保健院伦理委员会批准（批准号 2021-004），并在中国临床试验注册中心注册 (ChiCTR1800018795)，符合《赫尔辛基宣言》。所有参与者在被告知绒毛取样风险、不适和潜在并发症后提供了书面知情同意。数据已匿名化并保密，参与者有权随时退出或撤销样本的使用。无利益冲突。经书面同意允许长期存储和二次使用，样本将根据规定保存或销毁。我们纳入了不明原因复发性自然流产 (URSA, n = 20) 女性，定义为排除已知遗传、解剖、内分泌和自身免疫原因后，与同一伴侣连续妊娠丢失≥2 次且妊娠 28 周前，以及正常妊娠 (NP) 女性 (n = 20)。纳入标准为年龄 18 至 40 岁，单胎妊娠，孕周≤12 周。排除标准包括自身免疫性疾病、慢性感染、影响妊娠结局的干预措施以及遗传、解剖或内分泌异常。样本量基于既往研究和可行性设定为每组 20 例。
2.2. RNA 测序
收集 NP (n = 3) 和 URSA (n = 3) 的胎盘组织样本进行全转录组测序。使用 TRIzol (15596018CN, Invitrogen) 方法提取总 RNA。使用 NanoDrop 2000 分光光度计 (Thermo Scientific, USA) 评估 RNA 纯度和定量。使用 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA) 评估 RNA 完整性。具有合格纯度、数量和完整性的样本用于后续文库构建。转录组测序和分析由 OE Biotech Co., Ltd. (中国上海) 进行。差异表达基因 (|log2FC| > 1, adjusted P < 0.05) 使用 DAVID 进行基因本体富集分析，显著富集项的阈值为 P < 0.05。
2.3. 药物和试剂
BSGCD 配方由八种药用植物组成，如补充表 S1 所示，https://links.lww.com/STCM/A114，干重比例为 5:5:4:4:3:3:2:2。菟丝子 (批号 2408090212)、桑寄生 (批号 2407300532)、陈皮 (批号 2408160262)、杜仲 (批号 2404300442)、黄芩 (批号 2406070072)、白术 (批号 2401160032) 和甘草 (批号 2406020102) 来源于亳州华侨药业有限公司。阿胶 (批号 2403046) 由山东福牌阿胶有限公司生产。所有药材浸泡、煎煮、过滤，并在 60 °C 下通过旋转蒸发浓缩以获得浓缩提取物。提取物进一步在 -55 °C 下蒸发，并在干燥箱温度 -40 °C 和真空压力 <10 Pa 的条件下冷冻干燥，以获得 BSGCD 冻干粉（提取率为 33%）。所有草药材料和阳性对照药地屈孕酮 (DYG) (HJ20170221, Abbott Biologicals B.V.) 均购自山东中医药大学附属医院。
2.4. 动物
本研究使用的所有小鼠均购自北京华阜康生物技术有限公司（许可证号 SCXK [北京] 2024-0003），包括 8 周龄雌性 CBA/J 小鼠、雄性 DBA/2 小鼠和雄性 BALB/c 小鼠 (SPF，体重 [21 ± 1] g)。所有操作均符合实验室动物伦理指南，并经山东中医药大学伦理委员会批准（批准号 SDUTCM20250624003）。雌性 CBA/J 小鼠分别与雄性 DBA/2 和 BALB/c 小鼠以 2:1 的比例交配，分别建立 URSA 和 NP 模型，用于体内评估 BSGCD 的治疗效果。检测到阴道栓子的当天定为胚胎第 0.5 天 (E0.5)。将 30 只小鼠随机分为 6 组（每组 n = 5）。URSA 模型小鼠从 E0.5 开始每日给予低剂量 (2.9 g/kg/d)、中剂量 (5.7 g/kg/d) 或高剂量 (11.4 g/kg/d) BSGCD，或阳性对照 DYG (0.4 g/kg/d)。[16] 在 E12.5 处死小鼠，并评估妊娠结局以及胎盘铁死亡标志物。
2.5. 含 BSGCD 血浆制备用于 UHPLC–MS/MS
Sprague-Dawley (SD) 大鼠 (SPF，体重 [200 ± 10] g) 购自北京华阜康生物技术有限公司（许可证号 SCXK [北京] 2024-0003）。SD 大鼠随机分为 BSGCD 给药组和空白对照组（每组 n = 3）。给药组大鼠每日口服 BSGCD 冻干粉 2.8 g/kg，连续 7 天，并在最后一次给药前禁食 12 小时（使用成人等效剂量系数转换方法转换剂量）。[17] 第 7 天，在最后一次给药后 10、15、30、60、120、240 和 360 分钟从眼眶静脉丛采集血样。通过离心获得血浆，并将每个时间点的等体积血浆混合用于 UHPLC–MS/MS (U3000-Q-E, ThermoFisher Scientific) 分析。空白血浆从对照组在相同条件下采集。
2.6. 含 BSGCD 血清制备用于细胞培养
另一组 SD 大鼠随机分配到 BSGCD 给药组和对照组（每组 n = 3）。给药组大鼠每日两次口服 BSGCD 冻干粉 11.4 g/kg，连续 7 天。给药第 7 天，在最后一次给药后 60 分钟从腹主动脉采集全血，并分离血清。血清样本进行热灭活，通过 0.22 μm 过滤器过滤，并储存在 -80 °C 以备未来用于细胞培养实验。空白血清从对照组在相同条件下采集。
2.7. UHPLC–MS/MS 分析
使用 UHPLC 耦合 Q-Exactive Orbitrap 质谱仪分析 BSGCD 提取物和含药血浆的化学成分。色谱分离在 30 °C 下使用含有 0.1% 甲酸的乙腈/水流动相在 C18 柱上进行梯度洗脱。质谱仪在正离子和负离子模式下使用电喷雾电离运行，在 m/z 80–1200 范围内使用全扫描和数据依赖的 MS/MS 采集。碎裂通过阶梯碰撞能量实现。

数据处理和分子式分配是使用 Xcalibur 软件进行的，质量准确度阈值为 10 ppm。相同的分析方案应用于所有批次以确保可重复性。

2.8. 细胞培养和处理
HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞购自武汉精赛生物技术有限公司，分别在 RPMI-1640 (01-100-1ACS, BI) 和 DMEM/F12 (C11330500BT, Thermo Fisher Scientific) 中培养。所有实验均使用第 5 至 10 代的细胞。为了诱导铁死亡，将滋养层细胞用 Ras 选择性致死小分子 3 (RSL3) (R302648, Aladdin) 处理 12 小时，随后用低、中、高浓度的 BSGCD 含药血清孵育。对于基因沉默，将负对照 (NC) 和 2 个针对 GPX4 的小干扰 RNA (si-GPX4-1 和 si-GPX4-2) 使用 Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen) 以 100 nmol/L 的最终浓度转染到 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞中。为了验证 GPX4 沉默引起的表型变化是否与铁死亡有关，进一步使用铁死亡抑制剂铁死亡抑制剂 (Fer-1) (F129882-5 mg, Aladdin) 处理 GPX4 敲低细胞进行挽救实验。NC 和 si-GPX4 构建体的序列见 表 1。

表 1 针对 GPX4 的小干扰 RNA 序列。
寡核苷酸
正义链 (5′-3′)
反义链 (5′-3′)
NC
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
ACGUGACACGUUCGGAGAATT
si-GPX4-1
GCUACAACGUCAAAUUCGATT
UCGAAUUUGACGUUGUAGCTT
si-GPX4-2
GUAACGAAGAGAUCAAAGATT
UCUUUGAUCUCUUCGUUACTT

2.9. Transwell 迁移实验
使用 24 孔 Transwell 室 (3422, Costar) 评估 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞的迁移能力。处理后，将 1 × 10^5 个无血清培养基中的细胞接种到上室，在下室加入含 10% 胎牛血清 (04-001-1ACS, BI) 的完全培养基作为趋化剂。24 小时后，对迁移的细胞进行固定，用结晶紫染色，并在倒置显微镜下成像。

2.10. CCK-8 实验
使用细胞计数试剂盒 -8 (CCK-8) 实验 (C0037, Beyotime) 评估细胞活力。将 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞以每孔 5 × 10^3 个细胞的密度接种在 96 孔板中。处理后，加入 CCK-8 试剂，并将细胞在 37 °C 下孵育。使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度，细胞活力以相对光密度值表示。

2.11. 脂质过氧化实验
根据制造商的说明，使用商业试剂盒 (BC0025, BC1175 和 BC5415; Solarbio) 定量胎盘组织和滋养层细胞中的 MDA、GSH 和 Fe2+ 水平。使用 BODIPY 581/591 C11 探针 (D3861, Thermo Fisher Scientific) 评估脂质过氧化。细胞在 37 °C 避光下与染料孵育，用 PBS 洗涤，用 Hoechst 33342 (C1028, Beyotime) 复染，并在荧光显微镜下成像。

2.12. 表面等离子体共振分析
使用 Biacore T200 仪器 (GE Healthcare, USA) 测量黄芩苷 (B20570-20 mg, OriLeaf)、甘草 A (B50843-5 mg, OriLeaf) 和人 GPX4 蛋白 (HY-P702646, MCE) 之间的结合亲和力。通过标准胺耦合将 GPX4 共价固定在 CM7 传感器芯片 (29147020, Cytiva) 上。一系列分析物浓度 (1.56–50 μmol/L) 以 30 μL/min 的流速注入。数据使用 Biacore 评估软件处理，通过将结合曲线拟合到 1:1 Langmuir 模型来确定平衡解离常数 (K_D)。

2.13. 细胞热位移实验
收获 HTR-8/SVneo 细胞，并在补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 PBS 中裂解。细胞裂解物在室温下与 DMSO (D8371, Solarbio) 或指示的单分子化合物（最终浓度为 10 μmol/L）孵育 30 分钟。随后，将每个样品等分，在 37 °C 至 62 °C 的温度梯度下处理 5 分钟，然后在冰上冷却并离心。收集上清液用于 Western blot 分析。

2.14. 分子对接
在 GPX4 和 BSGCD 的 8 个核心活性化合物之间进行分子对接。配体结构从 PubChem 获得，使用 ChemBio3D Ultra 14.0 进行能量最小化，并使用 AutoDockTools 1.5.6 制备为 pdbqt 格式。GPX4 结构从蛋白质数据银行下载 (PDB ID: 8XYS)。使用 AutoDock Vina 1.2.4 进行对接，每个配体运行 20 次，并使用最低结合能进行评估。使用 PyMOL 可视化对接结果。

2.15. 定量实时反转录聚合酶链反应分析
使用 TRIzol 试剂 (15596018CN, Invitrogen) 从细胞和组织中提取总 RNA。使用 PrimeScript RT 试剂盒 (R433-01, Vazyme) 在 VeritiPro Thermal Cycler 上将 RNA 反转录为 cDNA，条件如下：50 °C 5 分钟，然后 85 °C 5 秒。使用 SYBR Green (CW2601, cwbio) 在 QuantStudio 1 Plus 实时 PCR 系统 (Thermo Fisher Scientific) 上进行 PCR 扩增。PCR 程序如下：95 °C 10 分钟；40 个循环，95 °C 10 秒，60 °C 30 秒；随后进行熔解曲线分析：95 °C 15 秒，60 °C 1 分钟，95 °C 1 秒。升温速率为 1.6 °C/s，反应体积为 20 μL。每个样品运行三次重复，并进行 3 次独立实验。使用 2?ΔΔCt 方法计算相对基因表达水平。引物序列见 表 2。

表 2 引物序列。
基因
来源
引物序列 (5′-3′)
GAPDH
Homo sapiens
Forward: GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
Reverse: TGGTGAAGACGCCAGTGGA
GPX4
Homo sapiens
Forward: CAGTGAGGCAAGACCGAAGT
Reverse: CCGAACTGGTTACACGGGAA

2.16. Western blot 分析
使用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解缓冲液 (R0010, Solarbio) 从细胞或组织中提取总蛋白。样品通过 SDS-PAGE (S8010, Solarbio) 分离并转移到硝化纤维素膜上，随后用 5% 牛奶 (D8340, Solarbio) 封闭。一抗在 4 °C 下孵育过夜。使用的抗体如下：GPX4 (1:1000, ab125066, Abcam)、Kelch 样 ECH 相关蛋白 1 (1:2000, ab227828, Abcam)、酰基辅酶 A 合酶长链家族成员 4 (1:10,000, ab155282, Abcam) 和 GAPDH (1:10,000, ab181603, Abcam)。对于统计比较，应用 2 尾 Student's t 检验 (2 组) 或带 Tukey 事后检验的 2 因子方差分析 (多组)。

2.17. 统计分析
所有数据均使用 GraphPad Prism 7.0 软件进行分析，结果表示为平均值 ± 标准误。使用 2 尾 Student's t 检验进行 2 组之间的比较，使用 2 因子方差分析后进行适当的事后检验进行多组之间的比较。使用 Pearson 相关系数评估连续变量之间的线性关系。P 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 铁死亡在不明原因复发性流产 (URSA) 的绒毛组织中激活
为了调查铁死亡是否可能参与 URSA 的发病机制，我们首先对从 URSA 患者和 NP 对照者获得的绒毛组织进行了 RNA 测序。转录组数据的基因本体论富集分析显示，与铁死亡相关信号通路相关的基因显著富集 (图 1A)。这一生物信息学证据促使我们在生化水平上验证这些发现。

图 1. URSA 患者绒毛中的铁死亡和氧化应激增加。NP 和 URSA 患者绒毛组织转录组数据的 GO 富集分析 (A)。人绒毛组织中 GSH、Fe2+ 和 MDA 水平的测量 (n = 20) (B–D)。小鼠胎盘组织中 GSH、MDA 和 Fe2+ 水平的定量 (n = 5) (E–G)。数据表示为平均值 ± 标准误。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。Fe2+，亚铁离子；GO，基因本体论；GSH，谷胱甘肽；MDA，丙二醛；NP，正常妊娠；ns，无显著性；SEM，标准误；URSA，不明原因复发性流产。

我们接下来测量了相同组织样本中铁死亡的关键标志物。与 NP 对照相比，URSA 患者的绒毛组织表现出 GSH 水平显著降低 (P < 0.0001; 图 1B)，同时丙二醛 (MDA) 水平 (P < 0.0001; 图 1C) 和亚铁离子 (Fe2+) 水平 (P < 0.0001; 图 1D) 显著积累。这些改变代表了铁死亡的经典生化特征。为了在受控的实验系统中进一步验证这些临床发现，我们分析了小鼠 URSA 模型的胎盘组织。一致地，与 NP 小鼠相比，URSA 模型小鼠的胎盘组织也显示出显著降低的 GSH 水平 (P < 0.01; 图 1E) 和增加的 MDA 水平 (P < 0.001; 图 1F) 以及 Fe2+ 水平 (P < 0.01; 图 1G)。综上所述，这些数据表明铁死亡在 URSA 的病理背景下被显著激活。

3.2. GPX4 下调驱动滋养层细胞铁死亡
鉴于谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 作为主调控因子的核心作用，它通过解毒脂质过氧化物来抑制铁死亡，我们假设其失调可能是 URSA 中观察到的铁死亡的基础。Western blot 分析证实，与 NP 对照相比，URSA 患者的绒毛组织中 GPX4 蛋白表达显著降低 (P < 0.05; 图 2A)。在 URSA 小鼠模型的胎盘组织中也观察到类似的降低 (P < 0.01; 图 2B)。为了建立 GPX4 缺乏与滋养层铁死亡之间的直接因果联系，我们在 2 种人滋养层细胞系 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 中采用了功能缺失方法。与 NC 组相比，转染 2 个独立针对 GPX4 的 siRNA 有效地在 mRNA (P < 0.0001; 图 2C) 和蛋白水平 (图 2D) 上敲低了其表达。在功能上，GPX4 敲低显著降低了 HTR-8/SVneo (P < 0.001, P < 0.0001) 和 JEG-3 细胞 (P < 0.0001) 的活力，这种效应部分被 Fer?1 处理挽救 (图 2E)。此外，GPX4 敲低导致细胞内 MDA 水平显著增加 (HTR-8/SVneo P < 0.001, P < 0.0001; JEG-3 P < 0.05)，与 NC 组相比，Fer-1 显著逆转了这种增加 (图 2F)。此外，GPX4 缺乏增强了脂质过氧化，BODIPY 581/591 C11 荧光染色证明了这一点 (图 2G)。综上所述，这些结果表明 GPX4 作为滋养层细胞对抗铁死亡的关键分子屏障。

图 2. GPX4 下调介导滋养层细胞铁死亡。NP 和 URSA 患者 (n = 20) 的人绒毛组织及小鼠 NP 和 URSA 模型 (n = 5) 的胎盘组织中 GPX4、ACSL4 和 KEAP1 蛋白表达的 Western blot 分析 (A–B)。通过 qRT-PCR 验证 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞中 GPX4 敲低效率 (n = 3) (C)。通过 Western blot 验证 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞中 GPX4 敲低效率 (n = 3) (D)。通过 CCK-8 实验测量 NC、si-GPX4-1、si-GPX4-2、si-GPX4-1 + ferrostatin-1 (Fer-1) 和 si-GPX4-2 + Fer-1 组中 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞的细胞活力 (n = 3) (E)。NC、si-GPX4-1、si-GPX4-2、si-GPX4-1 + Fer-1 和 si-GPX4-2 + Fer-1 组中 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞的 MDA 水平 (n = 3) (F)。通过免疫荧光染色检测 NC、si-GPX4-1 和 si-GPX4-2 组中 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞的脂质过氧化水平 (G)。数据表示为平均值 ± 标准误。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。ACSL4，酰基辅酶 A 合酶长链家族成员 4；Fer-1，铁死亡抑制剂 -1；GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶 4；KEAP1，Kelch 样 ECH 相关蛋白 1；MDA，丙二醛；NC，负对照；NP，正常妊娠；ns，无显著性；qRT-PCR，定量实时反转录聚合酶链反应；SEM，标准误；URSA，不明原因复发性流产。

3.3. BSGCD 改善 URSA 小鼠的妊娠结果并抑制铁死亡
在确立铁死亡参与 URSA 后，我们接下来寻求评估 BSGCD 的治疗潜力。我们利用了一种特征明确的小鼠 URSA 模型，其中怀孕小鼠从 E0.5 到 E12.5 每日接受低、中或高剂量 BSGCD 或阳性对照药 DYG (保胎丸) 的灌胃给药 (图 3A)。正如预期，URSA 模型组与 NP 组相比表现出显著更高的胚胎吸收率 (P < 0.0001)，然而，BSGCD 治疗以剂量依赖性方式改善了妊娠损失，高剂量组显示出最显著的保护作用 (P < 0.001)，与 DYG 相当 (图 3B, 3C)。同样，反映发育进度的胎盘和胚胎重量，均在 URSA 小鼠中通过 BSGCD 治疗显著恢复 (P < 0.01, P < 0.001, P < 0.0001; 图 3D, 3E)。

图 3. BSGCD 治疗改善了 URSA 小鼠模型的妊娠结果。URSA 小鼠模型中 BSGCD 治疗方案的示意图：URSA 模型小鼠从 E0.5 到 E12.5 接受不同剂量的 BSGCD 和 DYG，随后对妊娠结果进行全面评估 (A)。每组怀孕小鼠的代表性图像 (n = 5) (B)。每组胚胎吸收率 (n = 5) (C)。每组胎盘重量 (n = 5) (D)。每组胚胎重量 (n = 5) (E)。小鼠胎盘组织中 GSH、MDA 和 Fe2+ 水平 (n = 5) (F–H)。

补体 GPX4 mRNA 在小鼠胎盘中的表达情况，经不同剂量 BSGCD 处理后 (n = 3) (I)。经不同剂量 BSGCD 处理后，小鼠胎盘中 GPX4 蛋白表达的 Western blot 分析 (n = 3) (J)。数据以均值 ± 标准误表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。BSGCD，补肾固冲汤；DYG，地屈孕酮；Fe2+，亚铁离子；GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶 4；GSH，谷胱甘肽；MDA，丙二醛；ns，无显著性；SEM，均值标准误；URSA，不明原因复发性流产。为了确定改善的妊娠结局是否与铁死亡的调节有关，我们分析了胎盘组织中关键的铁死亡标志物。BSGCD 给药以剂量依赖性方式有效恢复了 GSH 水平（P < 0.05, P < 0.001；图 3F），减少了 MDA 的积累（P < 0.01；图 3G），并正常化了 Fe2+ 含量（P < 0.05, P < 0.001；图 3H）。有趣的是，虽然 GPX4 mRNA 表达在各治疗组间无明显变化（图 3I），但 Western blot 分析显示，经 BSGCD 处理的小鼠胎盘中 GPX4 蛋白表达有明显且呈剂量依赖性的恢复（P < 0.05, P < 0.001；图 3J）。这表明 BSGCD 的作用可能涉及 GPX4 的转录后调节或增强蛋白稳定性。综上所述，这些体内结果表明，BSGCD 能有效改善 URSA 的妊娠结局，且这一益处与减轻胎盘铁死亡和恢复 GPX4 蛋白水平密切相关。

3.4. 网络药理学将 BSGCD 吸收成分与铁死亡相关通路联系起来
为了确定负责 BSGCD 作用的生物活性成分，我们对给予 BSGCD 的大鼠血清样本（含药血清）进行了 UHPLC–MS/MS 分析（补充表 S2，https://links.lww.com/STCM/A114；图 4A）。总共鉴定出 34 种主要可吸收成分，主要分为黄酮类、酚酸类、酚类化合物和萜类化合物（图 4B）。我们进一步对这些 34 种成分进行了分类，并量化了每类化合物中的化合物数量（图 4C）。使用 SwissTargetPrediction、STITCH 和 HIT 2.0 数据库预测了这 34 种血清来源成分的潜在靶点，显著性阈值为 P < 0.05 和 FDR < 0.01。整合结果并去除重复后，共获得 573 个预测靶点。对这 573 个靶点进行通路富集分析，发现其在铁死亡相关通路中显著富集（图 4D）。这种计算预测表明，BSGCD 全身吸收的化合物在生物学上能够调节铁死亡信号网络，为体内观察到的抗铁死亡效应提供了合理的物质基础。
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BSGCD 吸收成分的网络药理学分析及其与铁死亡相关通路的关系。UHPLC–MS/MS 分析鉴定 BSGCD 含药血清的质谱（A）。显示 34 种鉴定成分分类的饼图（B）。显示每类化学成分中成分数量的表格（C）。大鼠血浆中鉴定的吸收成分预测靶点的 GO 富集分析（D）。BSGCD，补肾固冲汤；GO，基因本体论；UHPLC–MS/MS，超高效液相色谱 - 串联质谱。

3.5. BSGCD 上调 GPX4 以抑制滋养细胞铁死亡
为了在细胞水平直接测试 BSGCD 的抗铁死亡活性，我们用 RSL3（一种直接抑制 GPX4 的强效铁死亡诱导剂）挑战 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 滋养细胞。CCK-8 检测显示，随后用低、中或高浓度的 BSGCD 含药血清处理，以剂量依赖性方式显著挽救了 RSL3 诱导的细胞死亡（P < 0.0001；图 5A）。与此保护作用相印证，BSGCD 血清显著减弱了 RSL3 触发的 MDA 水平升高（P < 0.05, P < 0.001；图 5B），并有效抑制了脂质过氧化，这通过氧化型 C11-BODIPY 探针荧光强度降低得到证实（图 5C）。在机制上，Western blot 分析证实，与 BSGCD 含药血清共同处理逆转了两种细胞系中 RSL3 诱导的 GPX4 蛋白下调（HTR-8/SVneo: P < 0.05, JEG-3: P < 0.001；图 5D）。此外，进行了 Transwell 小室实验以评估铁死亡对关键滋养细胞功能的影响。RSL3 诱导的铁死亡显著损害了 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞的迁移能力。值得注意的是，BSGCD 处理有效挽救了这些功能缺陷，恢复了细胞迁移（图 5E）。这些发现重现了体内观察结果，并确认 BSGCD 对滋养细胞具有直接的抗铁死亡保护作用，其机制与维持 GPX4 蛋白表达有关。
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BSGCD 通过上调 GPX4 表达发挥抗铁死亡作用。HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞用 RSL3 处理，随后用低、中或高浓度的 BSGCD 含药血清处理。CCK-8 检测评估 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞的活力（n = 3）(A)。HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞中 MDA 水平的定量（n = 3）(B)。通过免疫荧光染色评估 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞中的脂质过氧化（C）。HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞中 GPX4 蛋白表达的 Western blot 分析（n = 3）(D)。HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞的 Transwell 迁移实验；代表性图像显示单独用 RSL3 处理或联合 BSGCD 含药血清处理后的细胞迁移（E）。数据以均值 ± 标准误表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。BSGCD，补肾固冲汤；GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶 4；MDA，丙二醛；ns，无显著性；SEM，均值标准误。

3.6. 黄芩苷和甘草苷 A 协同稳定 GPX4 并抑制滋养细胞铁死亡
为了鉴定 BSGCD 中直接靶向 GPX4 的成分，对先前检测到的 34 种吸收成分进行了分子对接。结果表明，多种化合物对 GPX4 表现出高预测结合亲和力（图 6A）。我们选择了排名靠前的候选化合物，并使用热图可视化它们的结合能（图 6B），而分子模型揭示了黄芩苷和甘草苷 A 在 GPX4 催化口袋内的具体结合姿态（图 6C）。此外，自由能景观分析表明，配体结合促进了更稳定的蛋白构象（图 6D）。这些相互作用通过表面等离子体共振（SPR）分析进一步验证，确认了黄芩苷和甘草苷 A 与 GPX4 蛋白的结合（图 6E）。细胞热位移分析（CETSA）进一步表明，这两种化合物，特别是联合使用时，显著增强了 GPX4 的热稳定性（图 6F）。为了评估它们的协同潜力，采用了 ZIP 模型，揭示了在 2.5 μmol/L 甘草苷 A 和 10 μmol/L 黄芩苷下具有显著的协同效应（图 6G）。最后，这种协同作用得到了功能验证。与单成分治疗相比，联合治疗在 CCK-8 检测中显著增加了细胞活力（P < 0.001, P < 0.0001；图 6H），并更有效地抑制了脂质过氧化，这通过 MDA 水平降低得到证实（P < 0.0001；图 6I）。综上所述，这些结果表明，黄芩苷和甘草苷 A 是 BSGCD 的关键生物活性成分，它们通过直接结合并稳定 GPX4 蛋白，协同抑制滋养细胞铁死亡。
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甘草苷 A 和黄芩苷稳定 GPX4 蛋白并抑制滋养细胞铁死亡。GPX4 与 BSGCD 34 种吸收成分之间分子对接的预测结合能（A）。显示排名靠前候选化合物结合能的热图（B）。显示黄芩苷和甘草苷 A 与 GPX4 蛋白结合相互作用的分子对接模型（C）。FEL 分析评估配体结合后 GPX4 的构象稳定性（D）。SPR 传感图显示黄芩苷和甘草苷 A 与 GPX4 的结合动力学（E）。CETSA 结果显示用甘草苷 A、黄芩苷或其组合处理后 GPX4 的热稳定性（F）。基于 ZIP 模型的协同分布图（G）。通过 CCK-8 检测测量细胞活力以验证协同保护作用（n = 3）(H)。证明协同抑制脂质过氧化的 MDA 水平（n = 3）(I)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。BSGCD，补肾固冲汤；CETSA，细胞热位移分析；FEL，自由能景观；GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶 4；MDA，丙二醛；ns，无显著性；SPR，表面等离子体共振；ZIP，零相互作用 potency。

4. 讨论
本研究提供了证据表明，在 URSA 小鼠模型中，BSGCD 与改善的妊娠结局有关，并伴随滋养细胞铁死亡的减轻。在 URSA 小鼠模型中，BSGCD 治疗与胚胎吸收减少、胎儿和胎盘重量增加以及铁死亡相关标志物水平降低有关，且呈剂量依赖性。在细胞水平上，BSGCD 含药血清减弱了滋养细胞中 RSL3 诱导的铁死亡，这伴随 GPX4 蛋白表达增加。这些发现表明，调节 GPX4 相关的铁死亡可能有助于 BSGCD 在 URSA 中的保护作用。
本研究的一个显著观察结果是，BSGCD 似乎对滋养细胞发挥调节作用，而滋养细胞对于早期妊娠期间母胎界面的建立和维持至关重要。[18–20] 滋养细胞的增殖、分化和侵袭受到氧化还原稳态的严格调节。虽然生理性氧化应激参与正常的细胞信号传导，但过度的氧化应激会促进铁依赖的脂质过氧化并触发铁死亡，[21] 从而损害滋养细胞功能，破坏胎盘发育，并导致妊娠相关疾病，包括子痫前期和复发性流产。[22,23] 与之前的报道一致，我们的结果显示，URSA 患者的绒毛组织和 URSA 模型小鼠的胎盘中激活了铁死亡相关通路，并伴随氧化还原失衡，其特征为 GSH 减少以及 Fe2+ 和 MDA 水平增加。尽管氧化应激在生理条件下也参与发育和免疫调节，[24] 但其在 URSA 病理背景下的过度激活可能会损害胎盘稳态。因此，BSGCD 减轻滋养细胞铁死亡的能力可能代表其治疗 URSA 的重要机制之一。
黄芩苷和甘草苷 A 被鉴定为与 BSGCD 调节铁死亡相关的关键生物活性成分。通过结合网络药理学与分子对接、CETSA、分子动力学模拟和 SPR 分析的综合策略，这些化合物被证明与 GPX4 相互作用并增强其稳定性。GPX4 是铁死亡的核心调节因子，通过还原脂质过氧化物和限制脂质过氧化，在胚胎发育和组织稳态中发挥 essential 作用。[25–27] GPX4 的遗传缺乏导致早期胚胎致死和铁死亡相关的组织损伤。[28–30] 一致地，GPX4 敲低显著增加了 HTR-8/SVneo 和 JEG-3 细胞对氧化应激诱导铁死亡的易感性。
从转化角度来看，这些发现为 BSGCD 在 URSA 中的潜在应用提供了机制支持，目前针对该病症的有效治疗选择仍然有限。目前 URSA 的临床干预主要集中在症状管理和免疫内分泌调节上，针对核心致病过程的功效有限。[31,32] 相比之下，BSGCD 作为多成分中药复方，可能对多个相互关联的病理通路发挥调节作用，包括氧化还原失衡和铁死亡。观察到的甘草苷 A 和黄芩苷之间的协同相互作用进一步支持了活性成分的合理组合可能增强疗效的概念。然而，需要进一步的研究来优化配方，表征其药代动力学和毒理学特征，并在设计良好的试验中评估临床疗效。这些步骤对于 BSGCD 的标准化和现代化至关重要。
本研究存在若干局限性应予承认。首先，尽管采用了多种体外和体内模型，但 URSA 在临床环境中的异质性可能会限制这些发现的普遍性。其次，BSGCD 及其活性成分的长期安全性和药代动力学特性仍有待系统评估。第三，本研究阐明了黄芩苷和甘草苷 A 通过稳定 GPX4 蛋白并发挥协同效应来抑制滋养细胞铁死亡。然而，这些化合物与 GPX4 之间的具体结合位点未进一步研究，这代表了本文的一个局限性。未来的研究将更详细地解决这个问题。
总之，本研究表明，BSGCD 及其生物活性成分甘草苷 A 和黄芩苷与 URSA 中滋养细胞铁死亡的减轻有关，这可能是通过稳定 GPX4 蛋白实现的。这些发现表明，GPX4 介导的铁死亡可能参与 URSA 的发病机制，并代表一个潜在的治疗靶点。通过调节滋养细胞中的氧化还原稳态和限制脂质过氧化，BSGCD 可能改善 URSA 的妊娠结局。综上所述，这些结果提供了一个支持在复发性流产中应用铁死亡调节策略的机制框架，并为 BSGCD 在生殖医学中的现代化和循证发展提供了实验证据。需要进行进一步的转化和临床研究来验证这些发现，并探索它们在异质性 URSA 人群中的治疗潜力。

伦理声明
本研究经山东省妇幼保健院伦理委员会批准（批准号 2021-004），并在中国临床试验注册中心注册（ChiCTR1800018795），符合赫尔辛基宣言。

所有参与者在被告知绒毛膜绒毛取样的风险、不适及潜在并发症后，均提供了书面知情同意书。所有涉及小鼠和大鼠的实验方案均按照实验室动物护理和评估协会的标准执行，并获山东中医药大学（中国山东省济南市）动物伦理委员会批准。许可证号：小鼠为 SDUTCM20250624003，大鼠为 SDUTCM20250418001。

利益冲突声明：作者声明，就本报告的内容而言，他们不存在任何利益冲突。

资金来源：本研究由以下机构资助：国家自然科学基金（81673981、82274575、82471704 和 82575078）、山东省自然科学基金重大基础研究项目（ZR2023ZD56）、山东省科技合作计划（2025KJHZ035）、山东省自然科学基金（ZR2022LZY011 和 ZR2024QH441）、国家中医药管理局共建项目（GZY-KJS-SD-2023-034 和 GZY-KJS-SD-2023-046）、山东省泰山学者项目（编号 TSTP20240513）、教育部中医药古典理论重点实验室开放研究项目、国家青年岐黄学者培养项目、山东省中医药高层次人才培养项目、山东省本科教育建设项目（Z2024231）以及山东中医药大学质量提升与创新项目（YJSTZCX2025094、YJSTZCX2025012）。

数据可用性声明：本研究呈现的原始贡献包含在文章及补充材料中。如有进一步咨询，请联系通讯作者。

作者贡献：Lu Liu 进行了实验、分析了数据并撰写了文章。Xiaoxiao Zhu、Liping Qin 和 Zhen Zhang 分析了数据并参与了文章撰写。Xinkui Liu、Wei Li、Huiyan Zu、Fang Li 和 Miaomiao Zhou 进行了实验并分析了数据。Xia Li 构思、资助并监督了该项目，并修订了文章。所有作者阅读并批准了文章最终版本。