本综述旨在探讨高危型人乳头瘤病毒（HPV）在乳腺癌中的作用。HPV已被确认为宫颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌及口咽部癌症的致病因素。在23个国家的研究中，高危型HPV在乳腺癌中持续被检出。HPV在乳腺癌中的检出率为32.7%，而在良性和正常乳腺对照组织中仅为7.6%。HPV阳性的良性乳腺病变可进展为HPV阳性的恶性肿瘤，提示HPV在癌变过程中发挥早期作用。HPV的生物学活性已通过检测乳腺癌组织中的HPV转录本、HPV致癌蛋白表达（HPV E6/E7）及HPV诱导的空凹细胞得到证实。来源于正常乳腺组织和母乳的HPV可使正常培养的乳腺上皮细胞永生化。HPV物质从生殖道和宫颈经血液及循环外泌体转移至乳腺存在合理的机制。HPV相关性乳腺癌可能通过“打了就跑”的因果机制发生。HPV疫苗接种使乳腺癌发病率降低18%至19%，为因果关系提供了支持性证据。其他致癌病毒，包括小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）、EB病毒（EBV）和牛白血病病毒（BLV），可能独立或与高危型HPV协同促进乳腺癌的发生。现有证据符合扩展的Bradford Hill因果标准。高危型HPV可能在部分乳腺癌中发挥因果作用。
引言
人乳头瘤病毒（HPV）是宫颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌和口咽癌的已确立病因。尽管HPV感染常见，但进展为恶性肿瘤相对罕见。具有致癌风险的高危型HPV对上皮细胞的持续感染是肿瘤发生的主要决定因素。
已鉴定出200多种HPV类型，其中15种被认为是致癌型（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、72和81）。其中，HPV16和HPV18占HPV相关癌症的大多数。传播主要通过性接触发生，但非性传播途径——包括血液、受污染的医疗器械、手部接触以及分娩时的垂直传播——也可能存在。
高危型HPV于1992年由Di Lonardo及其同事在罗马首次在乳腺癌中检出。后续病例对照研究一致证实，高危型HPV在乳腺癌中的检出率显著高于正常或良性乳腺组织对照。
为评估因果关系，研究人员应用了扩展版的经典A. Bradford Hill标准。这些标准包括：（i）病原体鉴定，（ii）流行病学关联强度，（iii）研究间的一致性，（iv）时间顺序，（v）暴露，（vi）实验证据，（vii）一致性，（viii）传播途径，（ix）生物学合理性，以及（x）致癌机制。
乳腺癌中高危型HPV的鉴定
高危型HPV已在多项研究和多个国家的乳腺癌中被检出。聚合酶链反应（PCR）是最常用的检测方法。在一项详细调查中，通过原位PCR和常规PCR并结合下一代测序（NGS），在60%的乳腺癌中鉴定出HPV序列。在同一研究中，免疫组织化学证实了HPV癌蛋白的存在。浸润性乳腺癌中的HPV E7癌蛋白如图所示。
乳腺癌组织中的HPV病毒载量极低。通过定量PCR估计，每10,000个细胞中约有5.4个HPV拷贝，而宫颈癌中每100,000个细胞中有130,000个拷贝。这种低病毒载量可能是因为“打了就跑”的因果机制，即病毒存在于早期而非晚期肿瘤发生过程中。
PCR技术存在公认的污染问题。如果存在污染，预期会同时发生在癌症和对照组中，但事实并非如此。在所列研究中，乳腺癌中HPV的检出率始终高于对照组。
下一代测序
在美国癌症基因组图谱（TCGA）队列中，855份乳腺癌样本中有50份检出HPV基因序列。其中，20份为高危型HPV类型（2.3%），30份为低危型类型（3.5%）。检出的高危型包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV35和HPV52。此外，在这些HPV阳性乳腺癌标本中检测到HPV蛋白E1、E2、E4、E5、E6、E7和L1。E1和E2对HPV复制至关重要，在整合过程中发挥重要作用，并增加致癌性E6和E7的表达。TCGA队列中乳腺癌的HPV转录本数量非常低（高危型2.3%，低危型3.5%），而通过PCR测序在乳腺癌中鉴定高危型HPV的频率通常为20%–30%。
流行病学
病例对照研究
在一项荟萃分析中，23个国家的48项病例对照研究中有43项在乳腺癌中检出高危型HPV。五项研究未检出HPV。HPV16和HPV18是最常鉴定的类型，在87%的研究中报告，而HPV33主要在亚洲人群中出现。HPV阳性乳腺癌的检出率为32.7%，而正常和良性乳腺组织对照为7.6%。乳腺癌病例与对照组之间的差异高度显著（p = 0.0001）。
中国和伊朗的研究结果一致。然而，其他研究的结果不一致，从五项研究的零检出到88%不等。由于出现这五项阴性结果的国家（法国、印度、中国、突尼斯和西班牙）HPV宫颈癌发病率较高，这些差异不太可能是由于HPV感染率低所致。HPV阳性乳腺癌发病率的差异可能归因于实验室技术的差异，包括新鲜或固定标本的使用、不同的PCR引物、标本采集时间和实验室技术技能。
合并病例对照数据
在3,650例乳腺癌病例中，有1,192例（32.7%）检出HPV。在1,915例正常和良性乳腺组织对照中，有146例（7.6%）检出HPV。差异具有高度统计学显著性（p = 0.001）。
前瞻性队列研究
在台湾一项涵盖61,872名女性的全国性队列中，随访时间为7.2年。HPV感染女性发生乳腺癌的可能性是同龄未感染女性的1.4倍。在所有年龄段中，HPV阳性女性患乳腺癌的风险比HPV阴性女性高21%–36%。
HPV患者的发病率为每10,000人年12.5例，无HPV者的发病率为每10,000人年9.81例。HPV组与非HPV组相比，乳腺癌的相对风险为1.27（95%置信区间1.20–1.34）。年龄大于49岁者更易发生乳腺癌。
然而，仍需更多前瞻性队列研究证明HPV感染先于乳腺癌发生。
宫颈癌与乳腺癌中的HPV
患有HPV相关宫颈瘤变的女性与普通人群相比，后续发生乳腺癌的风险增加。这是一个一致的观察结果。宫颈癌后乳腺癌诊断的平均年龄约为51岁——比一般平均年龄60岁年轻近十年。尽管此类病例占乳腺癌的比例较小，但提示宫颈HPV感染与乳腺之间存在关联。
HPV阳性乳腺癌在年轻女性中更常见
HPV阳性乳腺癌女性的平均诊断年龄为38岁，而HPV阴性乳腺癌女性为53岁。由于HPV是一种性传播病毒，主要影响年轻人，HPV阳性与年轻乳腺癌之间的关联与HPV在乳腺癌中发挥作用相符。
侵袭性乳腺癌中的HPV
高危型HPV DNA在侵袭性乳腺癌亚型中更常检出，包括三阴性（44.4%）和HER2+（48.4%）肿瘤，而Luminal A（23.9%）和Luminal B（30.1%）癌症中检出率较低。
乳腺癌中的多种致癌病毒
HPV不太可能单独导致乳腺癌。几种致癌病毒可能独立或协同促进乳腺癌的发生。除HPV外，还包括小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV，小鼠乳腺癌的病因）、EB病毒（EBV，与淋巴瘤和鼻咽癌相关）和牛白血病病毒（BLV，牛癌症的病因）。每种病毒在乳腺癌中的检出频率均高于良性或正常乳腺组织对照。病例对照研究报告MMTV的比值比为13.40，HPV为5.55，EBV为4.43，BLV为2.57，其中MMTV的关联最强。
在一项包含16项研究的荟萃分析中，14%的乳腺癌中显示HPV和EBV共感染。EBV和高危型HPV可同时存在于某些类型的人类恶性肿瘤中，尤其是口腔癌和乳腺癌；因此，这些病毒的癌蛋白可通过启动和放大上皮-间质转化协同增加此类癌症的侵袭能力。
良性乳腺组织可进展为乳腺癌
高危型HPV阳性的良性乳腺病变可能进展为HPV阳性的乳腺癌。同一患者良性及后续恶性乳腺组织中一致的HPV序列模式提示相同的病毒感染存在于两者中，支持HPV在恶性转化中的潜在作用。这是一个与因果关系相关的重要观察。
高危型HPV在乳腺癌中的机制和早期影响
HPV在乳腺癌中的致癌机制可能不同于宫颈癌。HPV可能在乳腺癌发生的早期阶段发挥其致癌作用，符合“打了就跑”的机制。例如，HPV E7癌蛋白已在良性乳腺病变中检出，但在同一患者的后续乳腺癌中未检出。然而，这些结果并不一致，因为在某些病例中，E7表达也同时存在于良性乳腺组织和后续乳腺癌中。
有实验证据支持“打了就跑”的HPV因果机制。Ferreira等人使用HPV驱动的口咽癌模型和CRISPR删除HPV E7基因。E7缺失的肿瘤最初消退，随后肿瘤随时间复发并产生新突变。
在一项实验小鼠研究中，Iwasaka等人（1992）证明HPV病毒序列并非维持转化状态所必需。他们得出结论，HPV 18可以以“打了就跑”的方式发挥作用。
与恶性鳞状细胞癌相比，癌前病变中鉴定出更高数量的HPV基因组。
这种“打了就跑”机制似乎不同于HPV相关的宫颈癌。实验证明，HPV E7转录本和HPV E7癌蛋白的存在是维持宫颈癌致癌作用的必要条件。
Ngan等人证明HPV可能在乳腺癌中发挥早期致癌影响。在该研究中，72%的良性乳腺标本中鉴定出HPV E7癌蛋白，而同一患者后续发生的乳腺癌中仅有30%检出。
乳腺癌中HPV E7癌蛋白转录本的数量非常低（高危型2.3%，低危型3.5%），而宫颈癌中HPV E7转录本数量很高。这已在Gannon等人的PCR研究中得到证实，该研究中无法鉴定HPV相关乳腺癌中的转录本。
低数量的HPV E7转录本与通过免疫组织化学和基因测序评估的24份乳腺癌标本中50%（12/24）鉴定出HPV E7癌蛋白表达形成对比。
因此，TCGA和其他研究中乳腺癌中HPV含量低、某些乳腺癌中缺乏HPV转录本、良性乳腺癌中HPV E7阳性而后续浸润性乳腺癌中HPV E7阴性，表明高危型HPV可能通过“打了就跑”机制导致部分乳腺癌。
还有证据表明HPV感染似乎增强APOBEC3B基因的生物学活性，该基因已知可导致乳腺癌风险增加。
HPV在乳腺肿瘤发生早期发挥作用的假说也可以解释为什么免疫受损患者中HPV相关乳腺癌的检出率并未增加。
乳腺癌中HPV的生物学活性
HPV在乳腺癌中的生物学活性可通过三种主要方式证明：（i）检测HPV转录本，（ii）病毒致癌蛋白的表达，（iii）鉴定HPV相关的空凹细胞。
HPV RNA转录本已通过美国癌症基因组图谱（TCGA）项目在乳腺癌中检出，并经Lawson等人证实。
HPV致癌蛋白已通过免疫组织化学在乳腺癌中得到证实。
此外，已在乳腺癌组织中鉴定出HPV诱导的空凹细胞。在宫颈细胞中，早期病毒蛋白E5和E6协同产生空凹细胞。由于空凹细胞构成巴氏涂片（Pap test）的细胞学基础，它们被认为是HPV感染的病征性特征。它们在乳腺组织中的存在为HPV生物学活性提供了有力证据。
HPV通过外泌体和循环血液从宫颈转移至乳腺
外泌体（extracellular vesicles）是由大多数细胞类型（包括癌细胞）分泌的膜结合颗粒。从病毒感染细胞释放时，外泌体可携带病毒蛋白和核酸。HPV E6和E7癌蛋白以及HPV DNA已在血清来源的外泌体中鉴定出。这些外泌体的蛋白质组成与其来源癌细胞高度相似。
高危型HPV和HPV癌蛋白已在HPV相关宫颈癌患者的外周血单核细胞和血浆以及健康献血者的血液中鉴定出。
这些发现为HPV物质从生殖道和宫颈转移至乳腺提供了合理的机制。然而，没有直接证据表明外泌体或血液中HPV或HPV癌蛋白的存在可导致HPV相关乳腺癌。
HPV对乳腺上皮细胞的永生化
细胞永生化代表致癌转化的早期指征。永生化乳腺上皮细胞可作为各种形式乳腺癌的前体细胞。
在一项开创性研究中，Band等人证明从乳房缩小标本中分离的HPV16和HPV18可使正常人乳腺上皮细胞永生化。未感染的乳腺上皮细胞通常在18–20代后衰老，而暴露于含HPV16或HPV18完整病毒基因组质粒的细胞持续增殖超过200代。
这些发现随后在同一实验室得到证实，使用来源于正常乳腺组织和母乳的HPV 16 E6和E7癌基因使正常乳腺上皮细胞永生化。有趣的是，不同的上皮细胞类型需要不同的病毒癌基因进行永生化：单独HPV E6、单独HPV E7或两者组合。然而，这些机制差异尚未与不同的乳腺癌亚型直接关联。
单独考虑时，Band等人和Wazer等人的永生化研究并不能证明HPV导致乳腺癌。但它们增加了整体证据。
HPV疫苗接种对乳腺癌预防的影响
在一项针对巴西年轻女性的人群研究中，HPV疫苗接种使乳腺癌发病率降低了18%至19%。该研究的目的是确定HPV疫苗接种对中低收入人群宫颈癌的影响。乳腺癌发病率被用作潜在的阴性对照。未预料到HPV疫苗接种会导致乳腺癌发病率降低。
该研究结果具有重要局限性。它基于人群而非直接数据。女性年龄较小，为20至24岁。乳腺癌在该年龄段非常罕见。所有女性均在巴西公共卫生系统内确诊。另一方面，由于巴西20至24岁女性人口众多（770万），该研究中该年龄段共鉴定出1,475例乳腺癌病例。
讨论与结论
病原体鉴定
高危型HPV已通过多种实验室方法在乳腺癌中检出，包括标准和原位PCR、下一代测序以及病毒癌蛋白的免疫组织化学检测。这是确定因果关系的基本要求。
关联强度、一致性、流行病学
高危型HPV已在23个国家的乳腺癌中鉴定出。已有阴性结果报告。乳腺癌中HPV病毒载量非常低，其鉴定在技术上困难。这可能解释了这些阴性结果。在病例对照研究中，乳腺癌中HPV检出率为32.7%，而正常和良性乳腺对照为7.6%。病例是对照的四倍，且具有高度统计学显著性。HPV16和HPV18是最常见的类型。
HPV感染女性患乳腺癌的风险高21%–36%。HPV阳性宫颈癌女性发生后续HPV阳性乳腺癌的风险增加。HPV检出率在侵袭性亚型如三阴性和HER2+肿瘤中也升高。
合并病例对照数据
在3,650例乳腺癌病例中，有1,192例（32.7%）检出HPV。在1,915例正常和良性乳腺组织对照中，有146例（7.6%）检出HPV。差异具有高度统计学显著性（p = 0.0001）。在43项病例对照研究中的38项（88%）中，HPV阳性乳腺癌病例与对照组之间的差异具有统计学显著性。
一项大型前瞻性队列研究证明，HPV女性发生乳腺癌的可能性是年龄匹配未感染女性的1.4倍。高危型HPV在乳腺癌中的检出率显著且一致地高于正常和良性乳腺组织。在中国和伊朗，除两个例外，高危型HPV在乳腺癌中的检出率一致高于对照。
多种致癌病毒
其他致癌病毒，包括小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）、EB病毒（EBV）和牛白血病病毒（BLV），也可能单独或与HPV联合促进乳腺癌的发生。病例对照研究显示MMTV（比值比13.40）的关联强于HPV（5.55）、EBV（4.43）和BLV（2.57）。
时间顺序
HPV阳性良性乳腺病变已显示可进展为HPV阳性乳腺癌。虽然这一发现提供了时间标准的确认，但仍需前瞻性队列研究。
暴露与传播
HPV主要通过性传播。病毒物质可能通过含有HPV DNA和癌蛋白的外泌体和血液单核细胞从宫颈转移至乳腺。然而，没有直接证据。
实验证据
从乳腺组织和母乳中分离的高危型HPV可使正常乳腺上皮细胞永生化，提供了致癌潜力的证据。这一证据证实了高危型HPV在正常乳腺上皮细胞中潜在影响癌变的能力。
生物学合理性
鉴于高危型HPV是宫颈癌和其他上皮癌的已确立病因，其参与乳腺癌在生物学上是合理的。支持证据包括检测到HPV转录本、HPV E6和E7癌蛋白的表达以及乳腺组织中HPV诱导的空凹细胞的存在。
致癌机制
HPV在乳腺癌中的致癌机制可能不同于宫颈癌。在宫颈癌中，病毒整合到宿主基因组可驱动HPV E6和E7的过表达，导致p53降解和pRb失活。这些机制似乎在部分乳腺癌中以类似方式运作。有实验证据表明“打了就跑”现象可能参与HPV相关的食管癌。低病毒载量、低数量的HPV转录本以及同一患者良性乳腺组织中存在HPV癌蛋白而后续乳腺癌组织中不存在，提示在高达50%的HPV相关乳腺癌中存在“打了就跑”现象。还有证据表明HPV感染似乎增强APOBEC3B基因的生物学活性，该基因已知可导致乳腺癌风险增加。
HPV疫苗接种对乳腺癌预防的影响
在巴西年轻女性中，HPV疫苗接种使乳腺癌发病率降低了18%至19%。这是高危型HPV感染可与乳腺癌相关的证据。然而，需要确证性证据。
HPV在乳腺癌中的因果作用
最重要的证据包括：（i）乳腺癌中鉴定出高危致癌性HPV，（ii）在43项病例对照研究中的88%中，HPV阳性乳腺癌病例与对照组之间的差异具有统计学显著性，（iii）在唯一的前瞻性队列研究中，HPV感染女性发生乳腺癌的可能性是同龄未感染女性的1.4倍，（iv）HPV疫苗接种降低了年轻女性乳腺癌的发病率。
总体考虑时，证据符合A. Bradford Hill标准。
A. Bradford Hill总结道：“所有科学工作都是不完整的——无论是观察性还是实验性。这并不赋予我们忽视已有知识的自由，也不赋予我们推迟在特定时间似乎需要采取的行动的自由。”因此，应鼓励接种HPV疫苗以预防乳腺癌和其他癌症。
结论
证据支持高危型HPV是部分乳腺癌的致病因素。
