《Frontiers in Oncology》：Circulating tumor DNA for minimal residual disease and recurrence surveillance in hepatocellular carcinoma: current evidence and a translational roadmap
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）在接受根治性治疗后，包括手术切除、局部消融和肝移植，复发仍是导致治疗失败的主要原因。目前的监测依赖于影像学和血清生物标志物，但影像学上的复发可能滞后于生物学复发。这一差距促使研究者将注意力集中在循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）及相关游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）方法上，作为微小残留病灶（minimal residual disease, MRD）评估和分子监测的候选工具。然而，在HCC中，复发的生物学机制具有异质性。治疗后的复发可能源于残留的恶性克隆、隐匿性肝内播散，或在慢性损伤肝脏中发生的从头肝癌发生。这种复杂性影响了检测方法的选择、结果解读以及对多模式风险评估的需求。基于肿瘤信息的ctDNA检测最适合追踪残留克隆性疾病，而基于甲基化的复合cfDNA方法也可能捕获低脱落疾病和易复发肝脏区域的生物学特征。现有研究表明，术后ctDNA阳性、连续阳性、分子负荷升高以及选定的高风险甲基化信号与根治性治疗后的复发风险相关。然而，在不同治疗场景和检测类别中，证据基础并不均衡，实验室方法尚未标准化，且二元化的可检测与不可检测报告方式很少能满足临床解读需求。因此，核心的转化问题是ctDNA/cfDNA信息应如何在现实的HCC监测路径中使用。当前证据支持将这些检测作为辅助性的分子风险信号，而非独立的治疗触发因素。本综述综合了现有证据，比较了不同的检测策略，概述了多模式实施中的障碍（包括标准化和成本问题），并提出了一条审慎的ctDNA引导下HCC复发监测的转化路线图。
2 复发生物学与HCC分子监测的理论依据
2.1 根治性治疗后复发的生物学异质性
HCC根治性治疗后的复发涉及多种重叠过程。残留恶性疾病可能以显微镜下肝内转移灶、血管肿瘤栓子或肝外微转移的形式持续存在，而多中心的从头肝癌发生则可在慢性损伤的肝脏区域中出现。这些机制可能共存，但对分子监测有不同的意义。早期与晚期复发的区分虽有用但不完美。早期复发常被解释为残留疾病或隐匿性播散，而晚期复发常归因于从头肿瘤形成。仅凭时间无法确定机制。术后血浆中匹配原始肿瘤的信号支持残留克隆性疾病，尤其是当该信号在连续样本中持续存在时。相反，未检测到原始肿瘤信号应被解读为未发现可追踪的疾病，而非治愈的证据。
2.2 HCC-MRD并非结直肠癌或肺癌中MRD的直接复制
MRD在不同实体瘤中含义不同。在结直肠癌和肺癌中，术后ctDNA常被解读为来自治疗肿瘤的残留恶性细胞的证据。这一逻辑在HCC中也相关，尤其是在伴有血管侵犯或其他高风险特征的肿瘤切除后，但持续存在的致癌性肝脏区域使情况复杂化。基于肿瘤信息的阳性结果在概念上对来自原始肿瘤的残留疾病具有特异性。阴性结果的含义更窄：所追踪的克隆在当时血浆中无法检测到。这并不排除低脱落残留疾病、低于检测限的采样或后期多中心肿瘤形成的可能性。更广泛的cfDNA方法回答了相关但不同的问题。甲基化特征、拷贝数模式、片段组学特征和复合cfDNA模型可能捕获超出原始克隆的风险。因此，一个实用的HCC-MRD框架应区分三个问题：是否可检测到来自治疗肿瘤的残留疾病、更广泛的血液信号是否指示易复发生物学、以及连续的分子变化是否应改变监测强度。
2.3 肝硬化与炎症肝脏产生复杂的cfDNA背景
肝硬化和发炎的肝脏增加了第二层信号复杂性。坏死性炎症、纤维化、血管重塑、再生活动和治疗相关的组织损伤会增加非肿瘤cfDNA并稀释肿瘤来源的片段。由于根治性治疗后的残留疾病通常体积较小，肿瘤分数可能接近检测限；因此，单一的早期阴性或阳性结果应谨慎解读。在临床应用中，这一背景支持连续性解读而非一次性二元报告。持续性阳性、转为阳性或分子负荷升高比孤立的早期阳性更具说服力，尤其是当与影像学、甲胎蛋白（AFP）/异常凝血酶原（DCP）动态变化、病理学和治疗背景一致时。
2.4 基于ctDNA和cfDNA的术后监测的生物学原理
ctDNA是血浆cfDNA中来源于肿瘤的部分，由于cfDNA半衰期短，其可能比影像学更快地反映肿瘤负荷的变化。治疗后持续存在的肿瘤源性DNA可能在影像学复发前即指示残留疾病。HCC研究通过将术后阳性、围手术期持续阳性和定量分子负荷与复发风险相关联来支持这一原理，同时显示连续动态变化比单次检测更具信息量。这一生物学基础支持一种风险更新模型而非单次检测的MRD标签。基于肿瘤信息的突变追踪最适合残留克隆性疾病，而甲基化和复合cfDNA模型可能更好地捕获低脱落疾病和区域效应风险。在实践中，任一结果都必须在多模式框架内进行解读。
3 ctDNA和cfDNA检测策略用于HCC-MRD
3.1 基于突变的ctDNA检测
基于突变的检测方法识别血浆中的体细胞变异。常见平台包括靶向测序、数字PCR和杂交捕获面板。在HCC中，反复改变的信号通路包括端粒酶逆转录酶（TERT）启动子激活、TP53突变、β-连环蛋白1（CTNNB1）激活、染色质重塑、细胞周期调控以及受体酪氨酸激酶或RAS信号传导。主要优势在于特异性。肿瘤相关突变在正确的临床背景下将血浆信号与恶性疾病联系起来。主要局限性在于低体积术后疾病的敏感性不足。阴性结果可能反映肿瘤分数不足而非无残留疾病。突变面板也存在覆盖范围限制，固定面板可能遗漏相关克隆，且从头复发性肿瘤可能不与原始肿瘤共享突变。
3.2 基于肿瘤信息的检测
基于肿瘤信息的检测首先对治疗肿瘤进行测序，然后在血浆中追踪患者特异性变异。这一设计提出了一个精确的问题：治疗后是否仍能检测到来自原始肿瘤的DNA？相同变异的持续存在或重新出现强烈支持残留或复发性克隆性疾病。优势在于特异性。基于肿瘤信息的检测将血浆分析与肿瘤组织关联，减少了歧义，有助于在极低等位基因频率下区分肿瘤来源信号与背景变异。在肝移植后可能特别有用，因为患者特异性肿瘤信号的重新出现不太可能反映持续的天然肝脏癌变。代价是操作复杂性，需要足够的组织、高质量测序、检测定制和周转时间，且在仅接受消融治疗或存档组织有限的情况下可能难以实现。
3.3 无肿瘤信息突变面板
无肿瘤信息突变面板是基于突变ctDNA检测的一种血浆-only实施方案，无需事先进行肿瘤测序，使用覆盖癌症或HCC中反复改变基因的预定面板。这种设计具有可扩展性，在组织不可用时（如消融治疗后或回顾性队列中）很有用。代价是解读的不确定性。由于检测未锚定于患者特异性肿瘤组织，低频血浆变异可能源自肿瘤、克隆性造血或其他来源。若无匹配白细胞测序，这一问题尤为突出。因此，无肿瘤信息面板最好被视为可扩展的监测工具和假设生成的MRD辅助手段，而非残留疾病的确定性证据。
3.4 基于甲基化的检测
基于甲基化的检测与HCC高度相关，因为异常甲基化在肝癌发生早期即可出现，并可在组织和血浆中检测到。与仅基于突变的方法相比，甲基化检测可检查反复出现的表观基因组模式，并在肿瘤分数较低时仍可能提供信息。其在HCC中的吸引力有两方面：可能提高低脱落疾病的敏感性，并可能捕获超出原始克隆的易复发生物学，包括区域效应风险和从头复发易感性。解读仍需谨慎。高风险甲基化信号可能指示肿瘤来源DNA、区域效应生物学或两者兼有。其近期角色最好被定义为复发风险分类、纵向监测和选择更密切监测的依据，而非来自原始肿瘤残留疾病的证明。
3.5 片段组学、拷贝数变异及其他cfDNA特征
片段组学和拷贝数分析将液体活检扩展到变异和甲基化之外。片段组学研究片段长度、末端基序、核小体足迹和全基因组断裂模式，而拷贝数分析评估血浆cfDNA中的染色体获得、缺失和局灶扩增。这些方法可能在肿瘤分数过低而无法进行稳健突变检测时提供额外信息。其吸引力在于广度：它们可以在不预先知道患者特异性突变的情况下捕获肿瘤来源或组织来源的信息，并可整合突变和甲基化数据。这在HCC中尤为重要，因为肿瘤脱落可变且复发生物学具有异质性。局限性在于成熟度，需要更大的HCC特异性验证队列、标准化流程和前瞻性复发聚焦研究。
3.6 复合cfDNA模型
复合cfDNA模型整合多个分子层面，包括突变、甲基化、片段组学、拷贝数变异和临床变量。这种方法契合HCC生物学，因为没有单一信号能捕获所有复发机制。基于肿瘤信息的突变追踪可识别来自原始肿瘤的残留疾病，而甲基化和片段组学特征可能提供关于低脱落复发或区域相关风险的额外信息。临床变量如微血管侵犯、肿瘤大小、AFP/DCP动态变化、肝硬化和治疗方式可进一步细化解读。复合模型也引入了复杂性，性能取决于模型训练、外部验证、人群校准和透明报告。
3.7 分析前与分析考量
分析前和分析标准化是比较HCC-MRD研究的核心障碍。预期信号通常接近技术检测限，因此采血管、血浆分离时间、离心条件、血浆体积、cfDNA提取、cfDNA投入量、测序深度、分子条形码、错误抑制和生物信息过滤均可改变结果。时间点也很重要。手术切除和消融可通过组织损伤和炎症释放非肿瘤cfDNA。过早采样可能稀释ctDNA或产生不稳定背景信号，过晚采样可能错过早期术后风险信息。克隆性造血是另一个主要混杂因素，低频血浆变异可能源自造血克隆而非HCC。匹配白细胞测序和仔细的变异过滤至关重要。阳性阈值不仅是技术设置，更是临床解读规则。
3.8 HCC-MRD中检测选择的实用解读
检测选择应遵循临床问题。当目标是检测切除肿瘤的残留疾病且有组织可用时，基于肿瘤信息的突变追踪具有说服力。当组织不可用时，无肿瘤信息面板或甲基化检测可能更实用。当低脱落或区域效应生物学是主要关注点时，甲基化和复合cfDNA方法可能增加价值。目前尚无检测可作为HCC中独立的治疗触发因素。阳性结果应支持更密切的影像学检查、缩短随访、重复检测或试验考虑；阴性结果应根据基线可检测性、检测灵敏度、肿瘤特征、治疗方式和肝脏区域风险进行解读。
4 根治性治疗后的临床证据
4.1 治疗前ctDNA与侵袭性肿瘤生物学
治疗前ctDNA提供了根治性治疗前的分子基线。它识别出可脱落可测量DNA的肿瘤，并使术后结果的解读更容易。HCC研究将治疗前ctDNA与不良生物学相关联。可检测到的ctDNA或较高的变异等位基因频率与肿瘤负荷、血管侵犯和复发相关结局有关。此信息应被视为风险富集，而非影像分期、肝功能、病理学或血清生物标志物的替代。
4.2 切除术后ctDNA
最直接的HCC-MRD证据来自切除研究，探讨明显的肿瘤切除后持续存在或重新出现的肿瘤来源DNA是否能识别出高复发风险的患者。Zhu等人的前瞻性研究使用连续ctDNA检测，发现围手术期阳性与较短的无复发生存期相关。Ye等人发现术后7-10天采集的血浆中ctDNA阳性患者的复发率高于阴性患者，且ctDNA独立预测无病生存和总生存。这些研究支持术后ctDNA检测作为风险标志物，但不应过度延伸结论。样本量不大，采样窗口各异，且尚无研究显示ctDNA引导的干预能改善生存。
4.3 连续监测与分子提前时间
连续监测是ctDNA价值的核心。单次术后结果可能受脱落、时机、手术相关cfDNA释放、检测灵敏度和克隆性造血的影响。重复阳性、转为阳性或分子负荷升高更可能反映有临床意义的复发生物学。现有HCC研究支持这一原则。分子提前时间仍未完全标准化，因其取决于检测设计、基线脱落、治疗方式、肿瘤生物学和监测计划。连续ctDNA的近期待值是风险更新，可能支持更早的影像学检查或缩短随访间隔。
4.4 甲基化定义的复发风险与cfDNA监测
基于甲基化的研究提供了补充证据。Kim等人开发了一种基于甲基化的分类系统用于评估切除术后从头复发风险。Javanshir等人将此概念扩展到血浆cfDNA甲基化，发现血浆甲基化信号在切除或移植后下降，在进展时上升。大型血浆甲基化研究也支持平台的可行性。甲基化检测可能对低脱落疾病、从头复发风险评估和纵向监测有价值。阳性甲基化信号可能反映肿瘤来源DNA、区域效应生物学或两者兼有，应被解读为复发风险细化而非来自原始肿瘤残留疾病的证明。
4.5 不一致的证据与二元阳性报告的局限
并非所有研究都支持简单的二元ctDNA阳性。Wehrle等人发现可识别的术后ctDNA本身与无复发生存无显著关联，但ctDNA衍生的肿瘤突变负荷（TMB）与较短的复发生存和更高的复发风险相关。这种不一致并未否定ctDNA监测的价值，而是表明信号汇总方式很重要。实际信息是，持续性阳性、负荷升高以及与其他风险特征的一致性应比孤立阳性更具权重。阴性ctDNA也应谨慎解读，尤其是在基线血浆阴性或低脱落肿瘤中。
4.6 证据综合
总体而言，当前证据支持ctDNA和cfDNA在HCC根治性治疗后的预后相关性。术后ctDNA阳性、持续分子可检测性、较高定量负荷和甲基化定义的高风险状态均与复发风险相关。证据在风险分层方面最强，在治疗决策方面最弱。尚无完成的HCC前瞻性试验显示ctDNA引导的监测或ctDNA触发的治疗能改善生存，因此在临床试验之外，ctDNA应保持为辅助性监测信号。
5 治疗方式特异性与多模式解读
5.1 手术切除
切除提供肿瘤组织用于病理学和基于肿瘤信息的检测设计，同时保留剩余肝脏。残留疾病和从头癌变在术后均相关。基于肿瘤信息的ctDNA阳性结果强烈提示残留克隆性疾病，当阳性持续或随时间增加时更强。阴性结果仅在特定背景下令人放心。
5.2 局部消融
消融带来不同问题。肿瘤组织可能不可用，局部坏死和炎症会增加cfDNA，早期影像学可能难以解读。连续cfDNA或ctDNA可能在此情况下有所帮助。持续或升高的信号在经过适当间隔后可能支持更早的重复影像学或多学科讨论。孤立的非常早期阳性应谨慎解读。
5.3 肝移植
移植移除了携带肿瘤的肝脏和硬化区域，使得移植后ctDNA解读在概念上更清晰。移植后患者特异性肿瘤信号更令人担忧残留或复发性疾病，而非持续的天然肝脏癌变。ctDNA可为既有的移植后模型增加动态信息，但不应取代标准监测。
5.4 跨治疗方式监测逻辑
在所有治疗方式中，ctDNA在多模式监测系统中最适用于纵向风险更新。应在可能时建立基线状态，孤立早期结果应谨慎解读，意外的分子发现应促使重复检测，所有结果应结合影像学、AFP/DCP动态变化、病理学、治疗方式、肝功能、病因和肝脏疾病背景进行解读。
5.5 AFP、AFP-L3、DCP/PIVKA-II及复合血清模型
AFP仍是HCC监测中使用最广泛的血清生物标志物，其表现因病因、分期和术后背景而异。关键问题不在于ctDNA是否应取代AFP或DCP，而在于ctDNA是否为已包含影像学和血清标志物的监测系统增加价值。
5.6 影像学
影像学仍是HCC复发监测的核心，因为治疗决策需要解剖定位。ctDNA的实际作用是调整影像学策略。升高或持续的分子信号可能支持更早的MRI或CT、缩短间隔或更密切的多学科讨论，而阴性分子结果不应取代影像学。
5.7 其他液体活检分析物
ctDNA是液体活检的一部分。循环肿瘤细胞（CTC）、外泌体、细胞外RNA等相关分析物提供了关于活性播散、肿瘤-宿主通讯和肝脏微环境的独特信息。它们在HCC-MRD中的即时作用不如ctDNA/cfDNA成熟，最好被视为补充工具。
5.8 ctDNA在多模式监测中的增量价值
ctDNA只有在改善现有工具之外的评估时才是有用的。其价值在高风险术后患者、低体积残留疾病、模棱两可的影像学和连续风险更新中最具合理性。一个实用模型将结合治疗方式、病理学、肝脏疾病背景、AFP/DCP动态变化、影像学和分子数据来识别适合标准随访、强化监测或试验转诊的患者。
6 临床实施与ctDNA引导的试验设计
6.1 基线分子分型
根治性治疗前的基线分型可确定肿瘤是否脱落可测量的分子信号，并指导后续解读。
6.2 早期治疗后重新评估
早期术后或程序后检测可提供初始分子重新评估，但最佳时机仍未确定。
6.3 随访期间的连续风险更新
连续监测比单次样本更具信息量。持续阴性结果可能支持继续标准监测，但不应证明减少影像学频率的合理性。相反，持续阳性、转为阳性或分子负荷升高可能证明重新评估影像学时机和随访强度的合理性。
6.4 ctDNA阳性应如何改变管理
ctDNA阳性不应直接触发治疗。其现实作用是支持强化影像学、缩短间隔、重复分子确认、多学科讨论和试验考虑。
6.5 高危患者富集用于辅助试验
ctDNA的一个有前景用途是试验富集。术后持续阳性、高分子负荷或高风险甲基化谱的患者可能具有比未经选择的患者更高的复发风险。
6.6 ctDNA清除与转换作为动态终点
ctDNA动力学也可作为试验终点。分子清除、持续阳性和从阴性转为阳性可能提供药效学或监测信息。
6.7 临床采用前所需的试验设计
HCC需要前瞻性试验，包括预定的采样计划、解读规则和行动算法。
6.8 资源利用、成本与降级
从卫生系统角度看，cfDNA引导监测的主要成本后果并非抽血本身，而是其产生的下游路径。阳性、升高或不一致的结果通常导致重复检测、更早的MRI或CT、更短的间隔和多学科讨论。经济收益需要更早的分子检测导致可挽救的复发、试验入组或可测量的结局获益。
7 局限、报告标准与未来方向
7.1 生物学局限
基于肿瘤信息的检测可能检测到残留克隆性疾病但漏掉多中心从头肿瘤，而甲基化检测可能捕获高风险区域生物学但无法证明来自原始肿瘤的恶性细胞持续存在。
7.2 技术与分析局限
技术局限涵盖分析前、分析和分析后全流程。低肿瘤分数、有限的cfDNA投入、测序错误、样本处理变异和克隆性造血均可影响ctDNA解读。
7.3 临床行动局限
即使准确的风险识别也未定义最佳应对措施。更频繁的影像学可能更早发现复发，但生存获益和成本效益尚未得到证实。
7.4 未来展望
最现实的未来方向是风险适应性监测，而非对所有治疗的HCC患者进行通用ctDNA监测。进展将依赖于术后采样、实验室工作流程、阈值报告、连续阳性、分子提前时间和管理反应的共同语言。
