克服维涅兰德固氮菌（Azotobacter vinelandii）中尿素与硝酸盐对生物固氮的抑制及甘蔗固氮内生菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）天然耐受性的比较研究

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Overcoming urea and nitrate inhibition of biological nitrogen fixation in Azotobacter vinelandii versus natural tolerance in Gluconacetobacter diazotrophicus

　　

氮素常是农作物生长的限制性养分，多数微生物亦需外源固定态氮以维持最佳生长。即便具备生物固氮（BNF）能力的微生物，通常也会调控代谢优先同化固定态氮。维涅兰德固氮菌（Azotobacter vinelandii）是研究BNF的模式微生物，因固氮过程能耗高，其BNF在铵、尿素与硝酸盐存在下被抑制；既往研究表明，尿素与硝酸盐对维涅兰德固氮菌BNF的强抑制源于其在胞内转化为铵。研究人员在缺失脲酶（ureABC）与硝酸/亚硝酸还原酶（nasAB）及铵转运蛋白（amtB）的菌株中，消除了高达15 mM尿素与硝酸盐对BNF的抑制，使氮酶（nitrogenase）在这些常见肥料输入下持续活性。与之不同，固氮菌甘蔗固氮内生菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）天然缺失上述途径，研究人员通过实验证明，尿素与硝酸盐虽延迟其初始生长速率，但氮酶活性与铵积累速率与无此类底物时相近，表明该菌BNF对上述氮源不敏感。这提示在优化生物肥料胞外产氮与菌株设计时需审慎考量固氮菌株的替代途径，并可借助途径敲除以保障固氮菌在工业肥料氮化合物存在下持续固氮。

研究背景与立项依据

氮素是全球粮食增产的核心限制因子，工业合成氮肥（尿素、硝酸盐）依赖Haber-Bosch等高能耗工艺，且带来面源污染与温室气体排放。生物固氮（BNF）由固氮微生物通过氮酶将N₂还原为NH₄⁺，是潜在可持续替代方案。然而模式固氮菌维涅兰德固氮菌（Azotobacter vinelandii）的BNF受铵、尿素、硝酸盐反馈抑制，既往研究提示尿素/硝酸盐的抑制实为其经脲酶（urease）和硝酸/亚硝酸还原酶（nasAB编码）转化为胞内铵后触发的次级调控。另一株植物内生固氮菌甘蔗固氮内生菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）基因组精简，天然缺失urease与nasAB同源基因，其对尿素/硝酸盐的响应机制未知。该研究发表于《World Journal of Microbiology and Biotechnology》，旨在解析两菌对肥料氮的抑制差异，并为生物肥料菌株设计提供去途径化策略。

主要关键技术方法

研究人员以维涅兰德固氮菌DJ（ATCC BAA-1303）及标记框无痕删除了ureABC、nasAB、amtB的三突变株AZBB883为材料；以甘蔗固氮内生菌PA1 5野生型及双拷贝amtB1/amtB2缺失株GABB034为材料。采用全细胞乙炔还原法（acetylene reduction assay）测定维涅兰德固氮菌氮酶活性；采用邻苯二甲醛法（phthalaldehyde method）定量GABB034胞外铵积累以间接反映固氮速率；通过系统发育树（Maximum Likelihood法，MEGA12与iTOL）与已注释基因组比对，普查代表性固氮菌中urease与nitrate reductase同源途径分布。

研究结果

Azotobacter vinelandii乙炔还原检测

野生型DJ在15 mM尿素下氮酶活性被抑制>99%，15 mM NaNO₃下降低约61%，3 mM NH₄Cl下>99%抑制；三突变株AZBB883在同等尿素/硝酸盐浓度下氮酶活性波动<8%，证实尿素与硝酸盐的抑制完全依赖胞内转化为铵，敲除ureABC+nasAB+amtB可解除高达15 mM水平的肥料氮抑制且无固氮生长适应度惩罚（代时2.9 h vs 野生型3.2 h）。

Gluconacetobacter diazotrophicus铵积累检测

GABB034在含1.25 mM天冬酰胺启动生长后，补加10 mM尿素或20 mM NaNO₃仅延长滞后期，待OD₆₀₀>0.5后胞外NH₄⁺积累速率与对照无异；野生型与GABB034在以尿素或硝酸盐为唯一氮源时均不生长，证明该菌既不能同化亦不通过转化铵来抑制BNF，其对尿素/硝酸盐呈天然不敏感表型。

固氮微生物中硝酸还原与脲酶途径比较

在选取的具实验验证BNF活性的模式固氮菌中，多数携带urease或nasAB同源基因，仅Clostridium pasteurianum与Gluconacetobacter diazotrophicus同时缺失二者，后者因基因组精简天然具备“肥料氮透传”特性。

讨论与结论翻译

研究人员指出，工业生物肥料菌株若要与现有尿素/硝酸盐肥料联用，必须避免在胞内将肥料氮转为铵而触发BNF阻遏。对维涅兰德固氮菌，无痕敲除ureABC、nasAB与amtB（AZBB883）可在15 mM尿素/硝酸盐下维持氮酶活力，且因仅失基因不失调控元件，遗传稳定性优于上调BNF的构建体。对甘蔗固氮内生菌，天然缺失urease与nasAB使其BNF本身不响应尿素/硝酸盐，仅初始生长因无法同化而延迟。普查显示该性状在固氮菌中罕见。综上，在生物肥料菌株优化中，将urease与nitrate/nitrite reductase途径作为删除起点，或优选天然缺失这些途径的宿主（如Gluconacetobacter diazotrophicus），可保障固氮菌在含工业肥料氮的土壤环境中持续向植物供应固定态氮，降低对Haber-Bosch氨的依赖。