动机驱动力影响着三基因转基因阿尔茨海默病模型中的运动功能和小脑变化

《npj Dementia》：Motivational drive influences motor and cerebellar alterations in the triple transgenic Alzheimer’s disease model

　　摘要
阿尔茨海默病（AD）早期就伴随着运动功能的改变，但动机状态和测试历史对这些变化的影响仍不甚明了。我们研究了6-8个月大的3xTg-AD雄性小鼠在不同组别中的运动能力、精细运动能力和分子生物学特征。3xTg-AD小鼠在开放场地测试中的活动量减少，但在奖励驱动的情境下（如单个颗粒取食测试、辐射臂迷宫测试、楼梯测试）这种运动减少现象不那么明显，这些情境下小鼠表现出更强的任务参与度，并且在多个精细运动指标上显示出更高的目标导向行为——这与情境依赖性的表现调节相符，而非运动能力的提升。肌肉力量有所下降，而运动协调性保持正常。腓肠肌中的肌肉抑素-卵泡抑素表达在不同基因型间没有差异，且关节形态即使在多次测试后也未受影响，这可以被视为一种训练效应。相比之下，3xTg-AD小鼠的小脑中COXIV和促凋亡标志物（BAX、切割型CASP3）水平升高，而多次测试暴露则使凋亡信号向着抑凋亡方向转变（Bcl-2和促Casp3）。这些发现共同表明小脑在疾病早期就存在脆弱性，并强调动机状态和重复任务暴露对AD模型中行为结果的影响。

引言
阿尔茨海默病（AD）是目前最常见的痴呆症原因，全球约有5000万人患病，预计到2050年这一数字将上升到1.25亿。该疾病的神经病理学特征是淀粉样β（Aβ）斑块和过度磷酸化的tau（pTau）的积累，这两者与神经元功能障碍和细胞丢失密切相关。这些病理过程与氧化应激和线粒体改变密切相关，支持了细胞能量失衡在疾病早期就出现的观点。尽管确切的因果关系仍有争议，但越来越多的证据表明线粒体功能障碍先于明显的神经退行性变化，并可能促进神经毒蛋白的积累。虽然AD主要表现为认知减退和记忆丧失，但越来越多的证据表明还存在更广泛的行为功能障碍，包括视觉空间和运动障碍。AD相关的运动缺陷表现为步态缓慢、肌肉力量减弱、平衡能力下降及灵巧性丧失。值得注意的是，精细运动障碍虽不专属AD，但可能在临床诊断前就已出现，并随着疾病的进展而逐渐恶化，这表明它们可能是AD相关功能衰退的早期表现。此外，肌肉结构的改变和力量减弱与AD风险增加有关；在转基因模型中，肌肉质量的损失与认知衰退的严重程度相关。肌肉抑素是一种关键的骨骼肌生长负调节因子，在某些AD小鼠模型中其表达发生改变，因此调节肌肉抑素信号通路被提出作为对抗肌肉萎缩的潜在策略。相反，卵泡抑素（FST）作为肌肉抑素的天然拮抗剂，可能有助于维持肌肉质量。然而，MSTN-FST轴在AD相关运动改变中的作用尚未完全明确。小脑在精细运动协调和运动学习中起重要作用，在多种神经系统疾病中已被广泛研究。新研究表明AD中也存在小脑功能障碍，尽管其对疾病进展的贡献尚不完全清楚。皮质-小脑可塑性参与运动和认知过程，小脑萎缩（尤其是前叶）与AD患者的步态和肢体协调障碍相关。

三基因敲除（3xTg-AD）小鼠模型能够再现AD的主要病理特征，包括从4到6个月大时Aβ的积累，使其适合研究早期肌肉骨骼和小脑的变化。我们评估了多种运动方面的指标，包括肌肉力量、协调性以及探索性和食物驱动的活动，以识别早期变化。为了探究潜在的外周和中枢因素，我们检查了肌肉骨骼参数（MSTN-FST mRNA表达和膝关节结构）、腓肠肌中的凋亡指标和线粒体标志物。先前的研究在啮齿动物模型和人类受试者中发现，体育活动和丰富的行为参与可能调节AD的进展和功能结果。在此背景下，重复任务暴露为研究行为参与与早期分子和功能变化之间的关系提供了机会。我们假设3xTg-AD小鼠的运动表现反映了肌肉骨骼改变与小脑功能障碍之间的早期相互作用。重要的是，常用的运动测试结果不仅受运动能力影响，还可能受到动机状态、情绪环境和代谢因素的影响。已有研究表明3xTg-AD小鼠存在代谢改变和中脑腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元的早期功能障碍，这表明动机可能超出单纯的运动缺陷对行为表现有贡献。然而，解决这些潜在的混淆因素超出了我们当前研究的范围。

结果
图1展示了实验的时间线和队列设计。
**队列1**：未经行为测试的对照组和3xTg-AD组动物被处死。nControl = 4；n3xTg-AD = 4。
**队列2**：首先使用握力测试（一天5次）评估肌肉力量，两天后进行5天的旋转棒测试（每天3次）。nControl = 10；n3xTg-AD = 9。
**队列3**：小鼠首先完成开放场地测试（OFT），随后在限制饮食条件下进行食物驱动的学习任务：辐射臂迷宫（RAM）、单个颗粒取食测试（SPRT）和楼梯测试。行为序列结束后一周小鼠被处死，称为RTE（重复测试暴露组）。nControl = 10；n3xTg-AD = 10。
**队列4**：从2.5个月大开始生活在丰富的环境中，接受定期处理、偶尔接触跑步轮、笼子重新布置和隐藏物等刺激，称为处理组。在6个月时评估其OFT表现。nControl = 7；n3xTg-AD = 7。
**队列5**：在Morris水迷宫（MWM）中分析探针测试期间的运动活动，MWM是空间记忆的黄金标准。nControl = 6；n3xTg-AD = 6。

**运动变化**
为避免跨测试干扰，我们在相似年龄和条件下使用独立的3xTg-AD和对照组小鼠来评估肌肉力量、协调性、探索性运动和依赖动机的运动活动。尽管体重相当（见图2A、补充表1、图S2A–C），但握力测试显示3xTg-AD小鼠的肌肉力量显著低于对照组（见图2B、C）。
**图2**：6个月大雄性小鼠的运动表现和探索性运动。A. 6个月时的体重。未检测到基因型差异。B. 每次试验的平均前肢握力。3xTg-AD小鼠的握力显著低于对照组。C. 单次试验的握力。检测到显著的基因型效应，但无试验效应。D. 螺旋棒测试中的失败潜伏期（训练天数的平均值）。未检测到基因型差异。E. 训练天数的螺旋棒表现。两组随时间均表现出改善，表明运动学习发生。
**队列2**：体重（A）：nControl = 6，n3xTg-AD = 7；握力和螺旋棒测试（B–E）：nControl = 10，n3xTg-AD = 9；开放场地运动（队列3和4）：F. 15分钟开放场地测试（OFT）中的行驶距离。整个过程中检测到显著基因型效应。G. 15分钟OFT前5分钟的平均行驶距离。3xTg-AD小鼠的行驶距离显著低于对照组。H. 从2.5个月大开始处理的小鼠在5分钟OFT中的行驶距离（队列4）。未检测到基因型差异。
**队列3**：nControl = 10，n3xTg-AD = 10；**队列4**：nControl = 7，n3xTg-AD = 7。数据以均值±SEM表示，个别动物标出。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001 vs. 对照组。统计细节见补充表1。
在评估协调性和平衡的螺旋棒测试中未检测到基因型差异（见图2D、E；补充表1）。所有小鼠在测试过程中都有所改善，停留在加速棒上的时间更长，表明运动学习正常。
在另一个接受早期定期处理和轻度环境丰富化的队列中，OFT中的行驶距离无基因型差异（见图2H；补充表1）。这一观察结果表明，重复的人类接触和轻度环境丰富化可能调节了标准饲养条件下的运动减少现象。
完成OFT的同一队列（队列3）随后进行了食物驱动的任务（见图1中的实验顺序），以评估在正面强化条件下的运动行为。在RAM中，初始空迷宫日的运动表现无基因型差异（见图3B；补充表2），表明基线探索能力相当。在学习阶段，由于动物取食颗粒的时间不同，未直接比较运动距离。训练天数内的颗粒消耗量（补充图S2D）显示3xTg-AD小鼠更早参与奖励获取，而对照组小鼠则逐渐增加。在探针日（当迷宫再次无颗粒时），3xTg-AD小鼠的行驶距离显著长于对照组（见图3C）。双向重复测量ANOVA（基因型×天数）显示基因型和天数之间存在交互作用，表明对照组有运动习惯化现象，而3xTg-AD小鼠没有（补充图S2E）。探针日行驶距离的增加可能反映了增强了的求奖探索行为，但无法与搜索策略效率的潜在差异区分开来。两种基因型的手臂偏好无差异，且低于随机水平（见图3A），表明运动增加与空间偏好无关。

**图3**：6个月大雄性小鼠的动机驱动运动、空间学习和精细运动表现。A. 报酬偏好表现为探针日正确使用手臂次数与总使用次数的比率。未检测到基因型差异；表现低于50%的随机水平，表明缺乏明显的空间偏好。B. 第1天（习惯化阶段）在空迷宫中的行驶距离。未检测到基因型差异。C. 在食物驱动下的探针日行驶距离。3xTg-AD小鼠行驶的距离显著长于对照组。
**队列3**：nControl = 9，n3xTg-AD = 9；**Morris水迷宫（MWM）- 队列5**：D. 四天内到达隐藏平台的逃逸潜伏期。显著的天数效应表明学习过程，检测到基因型效应，3xTg-AD小鼠的逃逸潜伏期更长。E. 探针测试期间到达前一个平台位置的潜伏期。未检测到基因型差异。F. 探针测试期间的行驶距离。未检测到基因型差异。
**队列3**：nControl = 6，n3xTg-AD = 6；**单个颗粒取食测试（SPRT）（队列3）：G. 培训天数内成功取食的颗粒数量。显著的天数效应表明两组都有学习，且检测到基因型效应，3xTg-AD小鼠总体上取食的颗粒更多。H. 最后一天用餐时间，以测试总时间的百分比表示。3xTg-AD小鼠的用餐时间显著长于对照组。
**队列3**：nControl = 9，n3xTg-AD = 9；**楼梯测试（队列3）：I. 培训天数内的成功率。检测到天数和基因型的显著效应。3xTg-AD小鼠第1天的初始表现与对照组相当，随后逐渐增加，而对照组小鼠表现为逐渐改善。J. 培训天数内的尝试时间。检测到天数、基因型和基因型×天数的交互作用。数据以均值±SEM表示，个别动物标出。显著性水平：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001 vs. 对照组。统计细节见补充表2–3。

在MWM中测试的另一个队列中，训练阶段的逃逸潜伏期显示显著的基因型和天数效应（见图3D；补充表2），表明3xTg-AD小鼠的空间学习较慢。然而，在探针日，到达前一个平台位置的潜伏期（见图3E）或60秒测试中的总行驶距离（见图3F）无基因型差异，表明两组之间的游泳能力相当。但在更详细的分析中，3xTg-AD小鼠进入目标象限的潜伏期延长（补充图S2F），而在目标象限中的停留时间无基因型差异（补充图）。临床观察让我们预期3xTg-AD动物在早期会出现精细运动能力的改变。在SPRT任务中，两种基因型都显示出随着训练天数的增加而逐渐改善的迹象，表明它们掌握了这项任务（图3G；补充表3）。总体而言，3xTg-AD小鼠在不同试验中收集到的颗粒数量比对照组更多。在最后一次测试日，3xTg-AD动物花费在进食上的时间也更长（图3H），这表明它们在任务中的参与度更高，而不是抓取准确性的差异。反映尝试次数和持续时间的参数在两种基因型之间也没有差异（补充图S2H，I）。在SPRT和RAM之后，经过一段时间的间隔，进行了阶梯测试，此时小鼠已经熟悉了颗粒。在这项任务中，3xTg-AD小鼠尝试获取颗粒的时间比对照组更长，尤其是在训练初期（图3J；补充表3）。这种差异随着时间的推移而减小，这通过基因型与时间之间的交互作用得到了体现。两组在第一天时的成功率大约都是20%（图3I）。3xTg-AD小鼠在第二天的表现迅速提高，并保持了这一水平，而对照组则表现出较慢的逐步改善。为了探究观察到的行为改变的分子机制，并区分基线分子特征与RTE和轻度食物限制相关的变化，我们将RTE小鼠（第三组）的肌肉骨骼和小脑分子特征与年龄匹配的、未接受过测试的对照组（第一组）进行了比较。仅对RTE组进行了关节形态学评估，以评估重复的行为测试是否伴随着明显的外周关节病变。RTE小鼠的详细组织学关节分析见补充结果、补充图S3以及补充表4和5。

**腓肠肌中的mRNA表达（qPCR）**
在对MSTN和FST的mRNA表达进行检测时，未发现基因型之间的显著差异（图4A，B；补充表6）。在RTE动物中，FST的水平低于未受测试的对照组（图4B），从而导致MSTN/FST比率增加（图4C），但这种变化与基因型无关。

接下来，分析了线粒体标记物COX4I1（图4E）、促凋亡蛋白BAX（图4F）和抗凋亡蛋白BCL2（图4G）的mRNA表达水平（补充表6）。这些参数均未显示出基因型、RTE或其交互作用的显著影响。然而，RTE动物的BCL2/BAX比率高于未受测试的对照组（图4H）。

**小脑中的mRNA和蛋白质表达**
小脑中线粒体标记物COX4I1（图5A）和促凋亡蛋白BAX（图5B）的mRNA水平在转基因小鼠中显著高于对照组小鼠（补充表7）。在RTE动物中，BAX的mRNA水平大约降低了20%（图5B），而抗凋亡蛋白BCL2的mRNA水平增加（图5C），导致BCL2/BAX比率显著升高（图5D）。这些与RTE相关的改变没有基因型效应。

**Western blot分析**
Western blot分析进一步证实了在蛋白质水平上的变化（图S1）。线粒体蛋白COXIV（图5E）和促凋亡蛋白BAX（图5F）在转基因小鼠中明显升高（补充表7）。RTE动物的BAX蛋白水平低于未受测试的对照组（图5F），而BCL2蛋白水平保持不变（图5G），导致RTE动物的BCL2/BAX比率相对于对照组增加（图5H；补充表7）。此外，切割的caspase-3水平在未受测试的3xTg-AD小鼠中升高（图5I），而pro-caspase-3水平在3xTg-AD小鼠中降低（图5J），但这种变化不影响它们的caspase-3比率。总的来说，这些发现表明减少的探索行为可能与情绪或动机状态有关，而不是由固定的运动缺陷引起的。尽管3xTg-AD小鼠在食物相关任务中的表现优于对照组，但在其他情况下则表现出不同的行为和分子特征。在人类中，运动与循环中的FST水平升高和MSTN水平降低有关64，尤其是在进行抗阻训练后65，尽管这些发现主要基于血液测量而不是肌肉组织。重要的是，MSTN/FST轴与肌肉力量和代谢调节的关系更为密切，而不是最大力量66。MSTN的给药可以诱导恶病质67，而FST可以减少脂肪积累并改善胰岛素敏感性68。鉴于我们研究中的RTE（重复性训练）与限制饮食相结合，减少热量摄入的代谢效应可能超过了任何类似训练的适应性变化。这一解释得到了正在快速减重的摔跤手的观察结果的支持，他们的FST水平降低，MSTN/FST比率升高69。我们的研究结果表明，MSTN/FST轴的调节主要与RTE和/或饮食条件有关，而不是基因型特定的肌肉变化。由于握力测量是从一个独立的未受训练的群体中获得的，因此无法推断MSTN/FST表达与肌肉表现之间的直接关联。因此，为了探索潜在的肌肉无力机制，接下来我们检查了线粒体和凋亡途径。由于运动表现依赖于外周肌肉的完整性和中枢协调性，我们在这两个层面上进行了检查。我们选择了腓肠肌，因为它特征明显且易于获取。此外，作为行走、跑步和游泳的主要肌肉，腓肠肌可能直接受到我们RTE模式的影响。此外，神经退行性变也可能发生在神经肌肉接头70,71,72,73。然而，在腓肠肌中，我们没有发现基因型相关的线粒体或凋亡标志物的差异（图4E–H）。鉴于本研究中应用的行为任务（特别是SPRT和 prolonged Staircase 模式）需要精细的运动协调和精确的运动控制，接下来我们关注了小脑，小脑是运动时间和协调的关键调节器74。近年来，小脑在阿尔茨海默病（AD）中的作用受到了越来越多的关注34。在APPswe/PS1dE9小鼠中，早在3个月大时，就已经在小脑中检测到可溶性APP衍生的Aβ寡聚体水平升高，并伴有平衡和运动协调缺陷，这些发生在斑块沉积之前75。在我们的3xTg-AD小鼠中，线粒体标记物COXIV在mRNA和蛋白质水平上都升高了（图5A, E）。线粒体异常被认为是AD病理生理学的早期事件8,76,77，多项研究表明，针对线粒体功能可以缓解AD相关的功能障碍和神经退行性变78,79。与我们的发现相反，在3个月大的Thy-1 APP小鼠的小脑中，即使在斑块形成之前，也报告了线粒体膜电位和ATP合成的降低，而在6个月大时，通过酶法检测到COXIV活性降低80。同样，在15个月大的雄性3xTg-AD小鼠的海马区也观察到线粒体Ca2+保留能力下降81。根据这些报告，预期的是COXIV表达降低而不是升高。然而，线粒体蛋白的表达升高并不一定意味着线粒体功能的增强。例如，在链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠中，尽管蛋白质水平降低，但皮层COXIV活性却增加了82，这表明在代谢应激条件下存在复杂的调节机制。因此，在我们的6-8个月大的动物中，COXIV表达的增加可能反映了疾病中间阶段的补偿性或应激相关的线粒体反应，而不是生物能量能力的改善。氧化应激已被认为会促进Aβ和tau蛋白的病理变化83，这反过来又可能导致凋亡途径的激活，从而增加神经细胞的脆弱性84。因此，接下来我们检查了小脑中的凋亡相关标志物。在3xTg-AD小鼠中，我们观察到了向促凋亡方向的转变，特征是BAX和CASP3水平升高，同时抗凋亡的BCL2和促凋亡的CASP3表达降低（图5B–D, F–J）。这些发现与6个月大的Thy-1 APP小鼠的报告一致，在那里也检测到小脑中促凋亡和抗凋亡因子比例的改变80。类似的促凋亡变化也在6个月大的雌性3xTg-AD小鼠的全脑匀浆中描述过85，以及在686, 1287和15个月大的海马区81，观察到BAX和CASP3水平升高，BCL2表达降低。然而，也报告了区域间的差异。在5个月大的雌性3xTg-AD小鼠的皮层中，CASP3和BCL2都升高，而BAX没有变化88；而在12个月大的3xTg-AD小鼠的海马区（性别未报告），则发现BAX和CASP3降低，BCL2升高87。综合考虑这些观察结果，表明凋亡相关变化可能是区域和阶段特异性的。在这种情况下，我们研究中检测到的小脑变化可能反映了早期或区域特异性的脆弱性，而不是整个大脑的统一凋亡反应。在行为组中，不同基因型之间的旋转棒测试表现没有差异。因为旋转棒的结果可能受体重影响（参见参考文献61中的性别差异），我们检查了这一变量；然而，这个群体中的3xTg-AD小鼠和对照组小鼠的体重相当，因此将其排除作为混杂因素（图2A；图S2A）。与我们的发现一致，一些AD小鼠模型并未表现出明显的运动协调缺陷74。此外，多项研究报告称3xTg-AD小鼠与对照组相比，旋转棒表现相似甚至有所改善61,89,90,91，这种效应被认为与tauP301L转基因有关。因此，我们研究中缺乏运动协调缺陷与先前的文献一致，表明在这个疾病阶段，粗大运动表现可能仍然得以保持。在我们的研究中，基因型相关的促凋亡标志物增加伴随着RTE诱导的BCL2/BAX比率升高（图5D, H），表明部分抗凋亡调节。这些发现提示RTE结合间歇性饮食限制可能减轻了小脑中的促凋亡倾向。反复的研究表明，体育活动在AD模型中具有有益效果38,92,93，包括减少神经病理负担和认知衰退，在某些情况下还降低了循环中的Aβ和tau水平94。长期运动也被报道可以改善外周器官功能并增强系统性的Aβ清除95。尽管我们的模式不代表结构化的训练，但观察到的抗凋亡转变与文献一致，表明反复的运动参与可以影响细胞存活途径。总体而言，3xTg-AD小鼠的运动行为似乎是由基因型相关的分子脆弱性和活动依赖的适应性反应之间的复杂相互作用所塑造的。虽然小脑中的促凋亡信号增强，但缺乏明显的协调缺陷表明在这个阶段，粗大运动表现可能得到了保持。在6-8个月大的小鼠中检测到的精细运动效率低下表明，已经存在微妙的运动变化，可能与小脑中的线粒体应激和凋亡信号增加有关。这些结果强调了在解释AD模型中的功能结果时考虑代谢状态和行为背景的重要性，并表明早期的运动变化可能是疾病进展的一个敏感但可修改的组成部分。这项研究有几个局限性。3xTg-AD小鼠模型仅捕捉了疾病过程的部分方面，而不是全部方面。此外，使用C57BL/6J小鼠作为对照组而不是同窝小鼠，尽管被广泛接受96,97，但仍可能将靶向转基因的效果与遗传背景、发育和母体影响的变异混淆。然而，三个基因杂合的配对动物只有1/64的情况会产生完全纯合的后代，使得基于同窝的小鼠比较变得不可能。联合组织学检查仅在RTE动物中进行。这种重复测试可能起到轻微的、类似训练的刺激作用，因此可能掩盖了基因型相关的关节负荷或精细运动使用的差异。因此，未受训练的动物的基线关节形态仍有待确定。虽然RTE和处理可能具有一些与环境丰富化相似的特点（例如，减少的新奇压力和增加的行为参与），但RTE模式并不对应于涉及连续笼子刺激或自愿运动的经典丰富化方案。同时，简单处理和环境熟悉化使未受训练的3xTg-AD小鼠的运动恢复正常，这突显了AD模型中行为结果的强烈环境依赖性。这种敏感性可能掩盖了真正的疾病相关效应，突显了包括未受训练动物的重要性。我们没有将分析扩展到动机、情绪或代谢因素的电路水平，而是专注于单一脑区的分析，而不是详细分析运动相关电路。最后，用于qPCR和Western blot分析的样本量相对较小，限制了分子结论的可靠性。方法动物 triple transgenic AD (3xTg-AD; B6;129-Tg (APPSWE, tauP301L)1Lfa Psen1tm1Mpm/Mmjax #034830-JAX36) 和对照组 (C57BL/6J) 雄性小鼠来自布达佩斯实验医学研究所的本地系群（关于对照品系的更多信息，请参见参考文献96,97）。实验开始时动物年龄为6个月，测试结束时约为8个月。成年小鼠以每组3-5只的方式饲养在Macrolon笼子中（40 × 25 × 26厘米），处于倒置的12小时光/暗周期下（晚上8点开灯，21 ± 1°C，50–60%湿度），提供食物（标准小鼠饲料，Charles River，匈牙利）和水，除非另有规定。为了提高收集颗粒的积极性（Dustless Precision Pellets? Rodent，纯化，45毫克，Bio-Serv，#F0021-J），在食物驱动的测试期间保持小鼠的体重约为初始体重的90%。所有实验程序均获得了当地动物健康和福利委员会（PE/EA/918-7/2019）的批准，并按照欧盟关于用于科学目的的动物保护的指令2010/63/EU进行，符合ARRIVE指南。样本量是根据文献中报道的类似实验确定的。行为测试所有测试都在黑暗阶段在红光照明下进行，并使用天花板安装的摄像头（Samsung SNB-7000）记录。行为数据使用Noldus EthoVision XT（Noldus，荷兰）或Solomon Coder进行分析。分析主要关注与运动相关的结果。除了Morris水迷宫（MWM）外，每个测试装置在动物之间都用20%乙醇清洗，水在受试者之间不更换。图1显示了实验的时间线和队列设计。队列1。（未受训练的动物）动物在未经事先行为测试的情况下被处死（每组n=4）。收集肌肉和脑组织用于qPCR和Western blot分析。握力测试（队列2）使用模拟式握力计（Pesola Medio-Line，40300）测量前肢的握力。六个月大的小鼠被允许抓住连接到力弹簧秤上的水平杆，弹簧秤在稳定后重置为0克。尾巴以恒定速度轻轻向后拉动，使动物建立抵抗力98。当小鼠从前爪释放杆子时，通过拖拽指针记录峰值拉力（克）。如果动物仅使用一只前爪或后肢、转身或无阻力地释放杆子，则试验被排除。连续五次测量间隔1分钟，平均值用于统计分析。旋转棒测试（队列2）握力评估三天后，使用带有自动计时器和跌落检测的加速旋转棒装置（IITC Rotarod Series 8，IITC Life Science）评估运动协调性和平衡。小鼠被放置在直径3厘米、表面有纹理的圆鼓上以减少滑动。旋转棒最初以每分钟5转的速度旋转，并在300秒内逐渐加速到25转/分钟99。当动物掉到下面的传感器平台上时，会自动记录跌落的潜伏时间。小鼠每天进行三次试验，每次试验之间至少间隔10分钟。每天的平均跌落潜伏时间用于统计分析。开放场地测试（OFT；队列3和4）在白色有机玻璃开放式场地（40 × 36 × 19厘米）中评估运动活动。小鼠被单独放置在一个房间里，允许自由探索，同时记录运动行为并离线分析。在代表标准饲养条件的队列3中，动物测试15分钟，总行进距离（厘米）被用作探索运动的指标。为了检查长期环境丰富化和反复处理后的运动行为，队列4的小鼠从2.5个月大开始就被置于丰富化环境中。丰富化包括反复处理、使用跑步轮以及额外的环境丰富元素（例如，避难所和新奇物体）。这些动物在6个月大时进行了5分钟的OFT测试。不同组别之间的测试持续时间差异反映了不同的实验目的，而不是直接进行组别间的比较。

**单颗粒取食测试（SPRT；第3组）**
在OFT之后两天，动物被维持在限制性饮食下，它们在一个由透明有机玻璃制成的三通道单颗粒取食盒中接受测试（每个通道深30厘米、宽10厘米、高30厘米），该盒子设计可同时记录三只动物的行为。每个通道的前右侧壁设有5毫米宽的缝隙。训练过程逐步进行：第一天，颗粒被放置在盒子靠近通道的位置；第二天，颗粒被放置在通道内部；在随后的7天内，颗粒被放置在通道外部，距离边缘5毫米处。小鼠需要通过缝隙将颗粒拉进盒子内。每只小鼠在15分钟的测试时间内最多可以收集15颗颗粒（如上所述），如果所有颗粒都被成功取出，则测试提前结束。被拉进盒子的颗粒被视为成功奖励。

**除了奖励获取外，最后一天还通过使用Solomon Coder软件量化进食时间比例以及取食尝试的次数和持续时间来进一步表征行为投入度。**

**辐射臂迷宫（RAM；第3组）**
在SPRT之后三天，小鼠被放入一个八臂辐射迷宫的中心区域（每个臂长25厘米、宽7.5厘米、高6厘米；中心区域直径20厘米），测试时间为10分钟，在此期间它们可以探索并收集颗粒。
**第一天，迷宫内没有颗粒，以便让小鼠适应环境。**
**第二天，在每个臂的末端放置了一颗颗粒，以帮助小鼠熟悉奖励位置。**
**在5天的学习阶段，连续三个臂被放置颗粒以强化学习效果。**
**第六天（探测日），迷宫内没有颗粒，小鼠被测试5分钟。**
**总旅行距离被用作在没有立即奖励的情况下，由学习到的奖励预期驱动的食物驱动的探索行为的衡量指标。**

**第1天和第6天的运动活动使用EthoVision XT进行跟踪和分析。**
**在探测日，臂偏好是通过计算访问过先前放置颗粒的臂的次数占总进入臂次数的百分比来确定的。**

**楼梯测试（第3组）**
实验装置包括一个较宽的起始区域，通向一个狭窄的走廊（整体尺寸为145×55×51毫米）。一个中央基座贯穿整个走廊，两侧各有一个狭窄的槽，用于放置可拆卸的双层楼梯。每层楼梯有八个台阶，每个台阶上有一个凹槽，用于放置45毫克的奖励颗粒。
**在RAM之后五天，第一天，颗粒被放置在中央基座上，以帮助小鼠熟悉奖励位置。**
**在接下来的5天内，颗粒仅放置在楼梯台阶上。**
**每只小鼠每次测试有15分钟的时间来用前爪收集颗粒。**

**所有6天的视频记录使用Solomon Coder软件进行分析。**
**测量了尝试时间（DT），即参与颗粒导向取食动作的累计时间，以及成功和未成功的颗粒获取尝试次数。**
**成功率（%）是通过成功获取颗粒的次数与总尝试次数的比例来计算的。**

**莫里斯水迷宫（MWM；第5组）**
一个由亮灰色塑料制成的圆形水池（直径90厘米、高40厘米）充满自来水（24±2°C），并用白色墙漆涂成不透明状。水面比平台表面（直径6厘米）高出1厘米。
**水池被分成四个象限，平台位于其中一个象限的中心。**
**小鼠从不同位置放入水中，自由游泳60秒以寻找平台。**
**如果未能找到平台，动物会被轻轻引导至平台并在那里停留10秒。**
**学习阶段（第1-4天）每天进行五次试验，试验间隔1小时，之后小鼠被送回饲养箱。**
**第六天（探测日），平台被移除，小鼠再次被允许游泳60秒。**
**探测期间的总旅行距离被用作游泳活动的指标（运动输出）。**
**此外，还使用EthoVision进行跟踪，以测量到达原平台位置的潜伏时间、在目标象限内停留的时间以及首次进入目标象限的潜伏时间。**

**由于第3组进行了具有相似环境背景和任务结构的多种行为测试，因此这种测试顺序构成了轻度类似训练的暴露。**
**为了避免暗示有意训练，这些小鼠在整个手稿中被称为重复测试暴露（RTE）组。**

**关节的组织学评估（第3组）**
**在楼梯测试后一周，动物被斩首处死，然后解剖下肢。**
**去除周围组织后，关节样本在PBS中清洗三次，并固定在4:1的乙醇和40%甲醛混合液中。**
**肢体重钙化处理4周，直到骨骼变得柔软。**
**然后样本在逐步升高的酒精系列中脱水，并嵌入石蜡中。**
**切割出7微米厚的连续切片，并根据制造商的说明使用二甲基 methane blue（DMMB）进行染色（Sigma-Aldrich，美国密苏里州）。**
**使用安装在Olympus BX53显微镜上的DP74相机拍摄显微照片。**
**使用之前描述的定制数学公式，从10倍放大的DMMB染色图像中测量关节软骨的厚度。**
**为了检查关节软骨中胶原纤维的相对丰度，使用了Picrosirius Red（Sigma-Aldrich，美国密苏里州）染色。**
**在带有λ/4补偿器的偏光显微镜下，粗胶原纤维呈现红色，而细纤维呈现绿色。**
**在恒定设置和曝光时间下使用Olympus BX53偏光显微镜观察样品。**
**在20倍放大图像中，使用ImageJ 1.40g软件量化红色和绿色像素。**

**由于与组织完整性和切片相关的技术限制，包括脱钙和组织学制备过程中偶尔出现的组织丢失或损伤，不同关节类型的可用分析动物数量有所不同。**

**定量PCR（qPCR；第1组和第3组）**
**第1组和第3组的小鼠被斩首处死，迅速解剖大脑和腓肠肌，并在干冰上快速冷冻，然后储存在-80°C直至分析。**
**在干冰上，小脑沿中矢状面切开，其中一个半球用于RNA提取。**
**使用RNAzol? RT（Merck，Sigma Aldrich，美国圣路易斯；#R4533-50ML）从腓肠肌和小脑组织中提取总RNA。**
**使用High-Capacity RNA-to-cDNA? Kit（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆；#4387406）进行逆转录。**
**使用NanoPhotometer NP80（IMPLEN GmbH，德国慕尼黑）检测RNA浓度和纯度。**
**qPCR反应使用SentiFAST SYBR Lo-ROX Kit（Izinta Trade Ltd.，匈牙利布达佩斯；#BIO-94005）在Applied Biosystems QuantStudio 5实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，美国）上进行。**
**样品重复两次，相对基因表达使用2?ΔΔCt方法计算，并以天真对照组平均值（第1组）进行标准化。**
**甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因。**
**引物使用Primer-BLAST（NCBI）设计，列在表2中，并由Bio-Science Kft（匈牙利布达佩斯）合成。**

**表2 qPCR分析中使用的基因表达引物序列**

**Western Blot分析（第1组和第3组）**
**从剩余的小脑中分离蛋白质。**
**组织在500 μL RIPA缓冲液中（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、150 mM NaCl、0.1% SDS、1% Triton X-100）中均质化，并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Sigma #PPC1010）。**
**蛋白质提取物与2× Laemmli缓冲液（4% SDS、20%甘油、0.004%溴酚蓝、0.125 M Tris HCl）混合，在95°C下变性10分钟。**
**蛋白质在15%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上（Bio-Rad #1620115）。**
**膜用含有0.02% Tween-20的5%脱脂牛奶在Tris缓冲盐水中封闭，并在4°C下过夜孵育，然后加入一抗：小鼠抗BAX（1:500，Santa Cruz #sc-7480）、小鼠抗BCL2（1:500，Santa Cruz #sc-7382）、兔抗caspase-3（1:1000，Abcam #ab13847）、兔抗COXIV（细胞色素c氧化酶亚基4 isoform 1，线粒体标记物；1:500，Cell Signaling #38563）和兔抗GAPDH（1:5000，Abcam #ab181603）。**
**洗涤后，膜在与辣根过氧化物酶偶联的二抗中孵育2小时：抗小鼠（1:2500，Promega #W4028）和抗兔IgG（1:2500，Sigma #SAB3700853）。**
**使用ECL化学发光试剂（Bio-Rad #170-5061）检测蛋白质条带，并用Li-COR C-DiGit? Blot Scanner 3600成像。**
**使用Image Studio?软件（LI-COR Biosciences）量化光密度。**
**每个目标蛋白质在适当的凝胶或膜段上分别进行分析。**
**实验独立重复进行，以验证抗体的特异性和重复性，重复实验结果一致。**
**展示膜分割的代表性图像见补充材料（图S1）。**

**数据分析**
**数据以平均值±SEM表示，并使用GraphPad Prism版本8.0.1（GraphPad Software）进行分析。**
**根据实验设计，应用单因素或双因素重复测量ANOVA或混合效应模型，必要时进行Tukey’s HSD事后检验。**
**在含有缺失值或样本量不等的数据集中使用混合效应模型。**
**统计显著性设定为p<0.05。**
**事后比较显示在图中，而主要ANOVA效应总结在补充表中。**
**图形使用BioRender（https://biorender.com/）、Adobe Affinity Designer 1.10.5和Vectornator Designer（https://www(vectornator.io/）创建。**