阿尔茨海默病中线粒体基质与膜间隙特异性应激反应

《npj Dementia》：Matrix and intermembrane space-specific mitochondrial stress response in Alzheimer’s disease

　　

**摘要**

阿尔茨海默病（AD）缺乏有效的治疗手段，部分原因是人们对线粒体功能障碍——神经退化的关键驱动因素——的理解尚不完整。线粒体通过激活线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）来维持蛋白质稳态，但在AD中，与线粒体基质和膜间隙（IMS）相关的应激反应的作用仍不清楚。在此，我们利用表达突变型淀粉样前体蛋白的人类小胶质细胞样细胞，并结合区室靶向的线粒体蛋白质毒性应激诱导物，研究了基质（UPRmt-MM）和膜间隙（UPRmt-IMS）应激反应。RNA-seq显示AD样细胞中线粒体应激通路激活以及突触和脂质信号抑制。UPRmt-MM促进强烈的免疫激活、严重的氧化磷酸化缺陷、线粒体活性氧增加和细胞死亡。相比之下，UPRmt-IMS优先诱导干扰素信号并抑制抗氧化通路。值得注意的是，抑制ATF5依赖性UPRmt信号可挽救线粒体功能障碍并减少Aβ释放。总之，这些发现表明，基质量和膜间隙靶向的线粒体应激会引发不同的小胶质细胞反应，并确定了线粒体蛋白质稳态作为AD潜在治疗靶点。

**引言**

阿尔茨海默病（AD）是一种以认知功能下降和淀粉样-β（Aβ）斑块及神经纤维缠结积累为特征的渐进性神经退行性疾病。尽管已有大量研究，但仍缺乏有效的疾病修饰疗法，很大程度上是由于对驱动疾病进展的分子机制理解不完整[1]。线粒体功能障碍已被证实是AD的早期且核心特征，涉及生物能量、氧化还原平衡和蛋白质稳态的障碍，并早于经典病理标志[2,3,4,5,6,7,8]。然而，连接线粒体功能障碍与神经退化的精确分子通路仍不完全明确。线粒体蛋白质稳态的关键调节因子是线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）[9,10]，这是一种适应性信号通路，通过诱导分子伴侣、蛋白酶和应激反应程序来维持蛋白质质量控制[11,12,13,14]。在AD背景下，Aβ[15,16,17,18]和过度磷酸化tau[19]均已被证实可激活UPRmt，且在实验模型和患者样本中观察到UPRmt相关基因表达升高[15]。然而，UPRmt相关信号在AD中是保护性还是病理性反应仍未解决。

重要的是，大多数研究将线粒体蛋白质稳态视为一个统一过程[20]，忽视了线粒体亚区室的功能异质性。线粒体基质（MM）支持三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化（OXPHOS）等核心代谢通路，并依赖专门的分子伴侣和蛋白酶进行酶折叠[21,22]。相比之下，膜间隙（IMS）容纳参与电子传递链（ETC）和凋亡信号的蛋白质，需要适应其独特氧化还原环境的特殊氧化还原酶系统[23,24]。这些区室激活专门的应激反应[25,26,27]，但它们在AD发病中的个体贡献仍很大程度上未定义。因此，全局性UPRmt相关信号可能缺乏特异性，并可能加剧功能障碍，凸显了区室特异性研究UPRmt信号的必要性。

在此，我们通过研究小胶质细胞中区室特异性线粒体蛋白质毒性应激来弥补这一空白，区分基质特异性（UPRmt-MM）和IMS特异性（UPRmt-IMS）应激反应。小胶质细胞是AD中神经炎症的核心介质，在突触重塑、免疫调节和病理性聚集体清除中发挥关键作用，这些过程高度依赖线粒体功能，因此对线粒体蛋白质稳态的破坏十分敏感[28,29]。尽管将小胶质细胞UPRmt与AD进展直接联系的体内证据有限，但使用人类诱导多能干细胞（iPSC）衍生模型的研究表明，UPRmt相关信号驱动代谢重编程、损害吞噬作用并促进促炎信号[30]。与此观察一致，小胶质细胞-脑组装体和类器官模型进一步揭示小胶质细胞中线粒体应激反应可破坏细胞间通讯并传播全脑衰老和神经退行性标志。总之，这些发现提示线粒体蛋白质稳态缺陷重塑小胶质细胞功能和细胞间网络，对AD中的神经炎症和退行性过程有贡献。鉴于小胶质细胞中的线粒体功能障碍通过促进炎症反应和损害毒性蛋白清除而加剧神经退化[28,29]，这些观察为研究区室特异性线粒体应激反应和小胶质细胞中UPRmt相关信号提供了有力依据。

为研究这些机制，我们使用稳定表达带有瑞典、佛州和伦敦突变的淀粉样前体蛋白（APP）的人类小胶质细胞样细胞（HMC3）（APPswe/F/L）[31]，从而模拟淀粉样生成应激。为研究区室特异性线粒体应激反应，我们使用了已建立的错误折叠蛋白模型，分别靶向MM或IMS。UPRmt-MM通过使用鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺失突变体（OTC-Δ）诱导[32]，而UPRmt-IMS则使用靶向IMS的错误折叠倾向双突变萤火虫荧光素酶[33]（IMS-Fluc-DM-mut）进行模拟。该方法实现了对转录反应、线粒体功能、氧化应激、淀粉样加工和细胞死亡易感性的系统分析。使用转录组谱分析和互补功能分析，我们检查了AD样小胶质细胞和区室特异性蛋白质毒性应激条件下的全局和线粒体基因表达变化。AD样小胶质细胞显示出线粒体应激通路和核糖体生物合成的激活以及突触和脂质信号的抑制。区室特异性应激以不同方式进一步放大了这些效应。AD-UPRmt-MM应激诱导强烈的免疫激活、NF-κB信号和严重的OXPHOS抑制，同时增加线粒体活性氧（ROS）并激活细胞死亡通路。相比之下，AD-UPRmt-IMS主要触发I型干扰素信号并抑制线粒体核糖体完整性和抗氧化防御。这些发现提示AD相关线粒体应激使小胶质细胞处于易损状态，而区室特异性损伤驱动不同的应激反应。在严重条件下，这种应激似乎会覆盖适应性UPRmt相关信号，表明AD中向病理性反应转变。此外，抑制ATF5依赖性UPRmt信号可恢复线粒体功能并减少Aβ释放，支持持续UPRmt信号在慢性APP相关应激下的病理性作用。总之，本研究为线粒体蛋白质稳态失败如何塑造小胶质细胞功能障碍提供了机制见解，并强调了区室特异性线粒体应激通路作为AD潜在治疗靶点。

**结果**

**区室特异性线粒体蛋白质毒性应激在AD样小胶质细胞中驱动不同的转录组特征**

为验证区室特异性线粒体蛋白质毒性应激，我们在稳定表达带有瑞典、佛州和伦敦突变的淀粉样前体蛋白（APP）的人类小胶质细胞样HMC3细胞中引入靶向应激诱导构建体，以下称为AD样细胞。基质特异性线粒体应激（UPRmt-MM）使用OTC-Δ诱导，而IMS特异性线粒体应激（UPRmt-IMS）使用与HTRA2靶向序列融合的IMS-Fluc-DM-mut模拟。两种构建体均为诱导区室特异性线粒体蛋白质毒性应激的已建立工具[32,33]，且已验证其线粒体靶向性。构建体表达通过定量PCR（qPCR）和共聚焦成像确认（补充图S1A-D）。qPCR显示与野生型（WT）和AD样（HMC3-APPswe/F/L）细胞相比，AD-UPRmt-MM细胞（HMC3-APPswe/F/L-OTC-Δ）中OTC-Δ和AD-UPRmt-IMS细胞（HMC3-APPswe/F/L-IMS-Fluc-DM-mut）中IMS-Fluc-DM-mut均表达丰富（补充图S1A, B）。共聚焦成像显示两种构建体相对于ATP5A1的线粒体定位，并作为线粒体靶向的支持证据（补充图S1C, D）。为直接确认区室特异性定位，我们进行了线粒体亚分级和去垢素依赖性蛋白酶保护实验（补充图S1E）。OTC-Δ在破坏两层线粒体膜之前均受蛋白酶消化保护，与基质定位一致，而IMS-Fluc-DM-mut在外膜透化后可被蛋白酶接触，与IMS定位一致。总之，这些数据为UPRmt构建体的准确区室特异性靶向提供了生化确认。

在建立区室特异性线粒体应激后，我们接下来使用RNA-seq检查全局转录变化。主成分分析（PCA）显示WT、AD、AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS细胞之间具有不同的转录组特征，PC1（47.19%）和PC2（17.00%）解释了大部分变异（图1A）。AD-UPRmt-MM样本分离度最大，表明转录重编程显著。差异表达分析在WT与AD之间鉴定出约3382个差异表达基因（DEGs），AD与AD-UPRmt-MM之间约1198个，AD与AD-UPRmt-IMS之间约327个（DESeq2，校正p < 0.05，|log2FC| ≥ 1）。热图显示不同的全局和线粒体表达模式（MitoCarta），在区室特异性应激下转录变化进一步放大（补充图S1F, G）。MitoCarta分析突出显示OXPHOS和蛋白质稳态通路的强烈失调，尤其在AD-UPRmt-MM应激下（补充图S1G）。线粒体编码的OXPHOS基因（MT-CYB、MT-CO3、MT-CO2、MT-ATP6）下调提示MM应激下复合体III-V活性受损，而AD-UPRmt-IMS上调干扰素相关基因（XAF1、IFI44L、OAS2、TRIM22、RSAD2、IFIH1），反映先天免疫通路激活[34,35]。总之，这些发现表明MM应激优先损害能量代谢，而IMS应激促进炎症信号。

**图1：APPswe/F/L表达和区室特异性线粒体应激下小胶质细胞的转录组变化。**

A 归一化RNA-seq计数的主成分分析（PCA）（每组n = 4个生物学重复），显示WT、AD、AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下样本聚类。坐标轴表示解释的变异（PC1、PC2；图中标注数值）。椭圆表示每组的95%置信区域。B-E 所示配对比较的全局差异基因表达火山图：B WT vs AD；C AD vs AD-UPRmt-MM；D AD vs AD-UPRmt-IMS；E AD-UPRmt-MM vs AD-UPRmt-IMS。x轴显示log?倍数变化（Log?FC）；y轴显示-log10（校正p）。红色表示显著上调；蓝色表示显著下调；灰色表示不显著（FDR/校正p < 0.05且Log?FC ≥ 1），除非图中另有说明）。代表性基因已标注。F UpSet图总结各比较间差异表达基因（DEGs）的重叠情况（阈值同B-E）。条形图显示唯一和共享集合；连接的点描绘交集身份。G 韦恩图总结各条件下显著调节基因的重叠，突出共享和独特的转录特征。统计阈值：FDR < 0.05；Log?FC ≥ 1；使用DESeq2计算生物学重复（每种条件n = 4）的校正p值。条件：HMC3-WT（WT）、HMC3-APPswe/F/L（AD）、HMC3-APPswe/F/L-OTC-Δ（AD-UPRmt-MM）和HMC3-APPswe/F/L-IMS-Fluc-DM-mut（AD-UPRmt-IMS）。H-J UPRmt相关和整合应激反应（ISR）蛋白（ATF4、ATF5、CHOP、DELE1、eIF2α、p-eIF2α、HSF1和p-HSF1）的Western blot分析，以及以GAPDH为内参进行ATF4和CHOP的灰度定量。数据代表生物学重复（每种条件n = 3）的均值±SEM。显著性用星号表示，****p < 0.0001（单因素方差分析配合Tukey事后校正，如方法部分所述）。

火山图和全局热图进一步展示了不同条件下的差异表达（图1B-E；补充图S1F）。与WT相比，AD样细胞上调了与细胞骨架组织和应激信号相关的基因（ALDH1A、RPS28、MAP1A、RPS28P7、TIE1、ID1、PML），下调了与代谢调节相关的基因（EPB41L3、SH3BGRL、MMP1、GPC4、SKAP2、TTLL7、ZNF518A、PLPPR4、E3B41L）（图1B；补充图S1F）。与AD样细胞相比，AD-UPRmt-MM诱导了先天免疫基因（RSAD2、TNFSF10、IFIT2、TNFAIP3、KLF4、FZD4、XAF1）同时抑制线粒体OXPHOS基因（MT-CYB、MT-CO3、MT-ATP6、MT-CO2、MT-ATP8、PLCE1、KIF20A）（图1C；补充图S1F）。相比之下，AD-UPRmt-IMS强烈上调了干扰素刺激基因（XAF1、IFI44L、OAS2、TRIM22、RSAD2、PIK3AP1、IFIH1）并下调与线粒体核糖体完整性相关的基因（EIF3C、FP、STX1A、RPS19、IPO4、HES5、ENDOG、ZSCAN）（图1D；补充图S1F）。AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS的直接比较揭示了不同的应激特征，MM应激与代谢功能障碍和生存通路相关，IMS应激与抗病毒和炎症信号相关（图1E；补充图S1F）。

交集分析进一步定义了共享和独特的转录反应（图1F, G）。WT与AD样细胞之间显示了最大的DEG集合（2713个基因），而AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS贡献了额外的应激特异性子集（分别为284和313个基因）（图1F）。一组10,933个核心基因在所有条件下共享，而独特子集（WT：399；AD：217；AD-UPRmt-MM：274；AD-UPRmt-IMS：80）突出了区室特异性转录重编程（图1G）。这些发现表明APP驱动和区室特异性线粒体应激协同重编程小胶质细胞中的转录网络。

为确定区室特异性应激是否改变整合应激反应（ISR），我们检查了关键通路蛋白。在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS两种条件下，我们检测到上游应激感知通路与下游UPRmt相关转录成分之间的明显分歧。eIF2α磷酸化（p-eIF2α）在两种模型中均明显升高，表明ISR强烈激活。相比之下，经典UPRmt转录因子ATF4、DELE1和CHOP的蛋白水平显著降低，ATF5无变化（图1H-J；补充图S1H-I）。这些发现表明持续ISR激活伴随经典ATF4-CHOP-ATF5 UPRmt相关转录轴的活性降低。p-eIF2α的同时上调表明胞质应激反应激活且p-HSF水平无变化（图1H；补充图S1J, K）。p-eIF2α的选择性诱导与经典UPRmt相关转录因子的抑制相结合，表明从线粒体蛋白质稳态程序转向替代性的分子伴侣介导的应激反应并促进应激反应基因的翻译。总之，这些数据表明基质量和膜间隙靶向的线粒体应激在AD样小胶质细胞中引发不同的应激反应程序，其特征为持续ISR激活、UPRmt相关信号改变和HSF1诱导。这些发现补充了转录组分析并支持了区室特异性线粒体应激在AD样小胶质细胞中驱动差异细胞反应的结论。

**AD样小胶质细胞和区室特异性线粒体应激下的免疫激活和生物能量抑制**

为获得DEGs的功能见解，我们进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析（图2A-D；补充图S2A-H）。

WT与AD样细胞的比较显示，线粒体应激、蛋白质稳态和凋亡通路发生富集，包括线粒体外膜通透化（MOMP）、蛋白水解调节以及线粒体通透性转换孔（MPTP）开放（图2A；补充图S2A、B）。上调的生物学过程包括核糖体生物发生、线粒体膜组织和蛋白质质量控制，表明线粒体翻译和蛋白质稳态增强。其他富集条目与细胞骨架组织和泛素介导的蛋白质周转相关（补充图S2A）。相比之下，下调的通路主要与突触功能和脂质信号相关，包括突触囊泡胞吐、钙调节的神经递质释放以及囊泡融合（补充图S2B）。这些变化表明，AD样小胶质细胞从神经元通讯向应激适应发生转变。固醇响应和胶原激活信号的抑制提示脂质稳态和细胞外基质组织受到破坏36。与此一致的是，突触调节因子（STX1B、SYT2、SNAP25）和脂质代谢基因（ABCA1、CYP1B1）发生下调。综合来看，这些结果表明AD样条件诱导线粒体应激和核糖体生物发生，同时抑制突触和脂质相关通路，与AD中观察到的神经退行性表型一致37。图2：功能富集分析揭示了APPswe/F/L表达以及区室特异性线粒体应激下的不同通路。全尺寸图像A–D 与图1B–E所示的相同四种两两比较的GO富集条形图。富集分析中的上调-下调图提供了一条具有方向意识的通路调控视角，展示每条富集通路主要由上调基因（红色）还是下调基因（蓝色）驱动，并配以显著性（–log10 FDR/校正p）值。所选通路着重强调应激信号、免疫反应、蛋白质稳态和线粒体功能。HMC3-WT（WT）、HMC3-APPswe/F/L（AD）、HMC3-APPswe/F/L-OTC-Δ（AD-UPRmt-MM）、HMC3-APPswe/F/L-IMS-Fluc-DM-mut（AD-UPRmt-IMS）。与AD样细胞相比，AD-UPRmt-MM诱导了强烈的免疫和炎症信号，包括细胞因子介导的通路、抗病毒反应和干扰素信号（图2B；补充图S2C），伴随RSAD2、TNFSF10、IFIH1、OAS2和TRIM22的上调。相比之下，线粒体能量代谢和蛋白质合成通路显著下调，包括OXPHOS、ATP生物合成和细胞质翻译（补充图S2D）。下调基因包括线粒体编码的电子传递链组分（MT-ND1、MT-ND4、MT-CO1和MT-ATP6），表明线粒体呼吸受损。综合来看，这些发现表明AD-UPRmt-MM促进免疫激活与严重能量代谢抑制的偶联。类似地，AD-UPRmt-IMS应激激活了免疫和抗病毒程序，包括TLR和趋化因子信号，伴有CXCL10、CXCL11、RSAD2、IFI44L和OAS2的上调（图2C；补充图S2E）。下调通路包括与MM应激重叠的OXPHOS和线粒体膜组织（补充图S2F）。然而，IMS应激更显著地激活了干扰素驱动的应答，对代谢通路的抑制相对较少，表明存在不同的区室特异性应激应答程序。AD-UPRmt-MM与AD-UPRmt-IMS的直接比较揭示了不同的功能特征（图2D；补充图S2G、H）。AD-UPRmt-MM显示更强的细胞因子信号、趋化和抗病毒防御诱导，关键基因包括TNFAIP3、CXCL10、CXCL11、RSAD2和IFIH1。相比之下，代谢和翻译通路在MM应激下受到更强烈的抑制，包括OXPHOS、ATP生物合成和细胞质翻译（补充图S2G）。相应地，线粒体编码的电子传递链组分（MT-ND1、MT-ND4、MT-CO1和MT-ATP6）和核糖体基因发生下调，表明线粒体呼吸和蛋白质合成受损（补充图S2H）。综合来看，这些模式表明MM应激驱动的免疫激活与能量代谢抑制比IMS应激更为显著，突出了线粒体应激相关转录重编程中的区室特异性差异。这种免疫激活与能量衰竭之间的失衡可能促成AD中的神经退行性进展。基质和IMS靶向的线粒体应激在AD样细胞中重塑线粒体基因网络为识别线粒体相关转录本，我们使用精心整理的MitoCarta 3.0基因集筛选全局RNA-seq数据集。差异表达的线粒体基因（FDR < 0.05，|log2FC| ≥ 1）以火山图呈现（图3A–C；补充图S3A）。与WT相比，AD样细胞表现出显著的改变，参与线粒体核糖体组装和OXPHOS的基因上调（MRPS18A、SLC25A22、MRPS11、ENDOG、NDUFA3、TMEM11、ATP5ID和MRPS34），而与脂质运输和丙酮酸代谢相关的基因下调（OSBPL1A、PDP1、PDK4、AK3、GLS、ABAT、MGARP、SLC25A40）（图3A）。这些变化提示AD样细胞通过增强线粒体翻译和呼吸复合体组装进行适应性反应，同时降低了代谢灵活性。这种模式与早期代偿性反应一致，在长期应激下可能难以持续。图3：基质和IMS靶向的线粒体应激诱导不同的线粒体应激应答程序。全尺寸图像A–C 限制为线粒体基因（MitoCarta集）的火山图，针对相同的两两比较（仅线粒体子集）。显示方式与图1B–E相同；阈值（FDR < 0.05；|Log?FC| ≥ 1），除非图中另有注明。D 不同条件下UPRmt标志基因的热图，突出显示基质驻留分子伴侣/蛋白酶和IMS应激感受器：示例包括HSPD1/HSP60、HSPA9/mtHSP70、LONP1、CLPP、ATF5（MM）和HTRA2/OMI、OMA1、DELE1（IMS）。行按z分数标准化；层次聚类基于表达相似性对基因和样本进行分组；FDR/校正p < 0.05且Log?FC ≥ 1。E、F 显示UPRmt相关标志表达量的条形图（E）MM相关UPRmt基因和（F）IMS相关UPRmt基因。条形图显示归一化的RNA-seq丰度（如DESeq2归一化计数/TPM/FPKM；相对于对照的倍数变化，如图所示）。数据代表生物学重复间的SEM（每种条件n = 4）。统计学显著性以星号表示：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001（来自DESeq2的校正p或带有Tukey事后校正的单因素ANOVA，如方法部分所述）。在AD-UPRmt-MM条件下，与铁硫簇运输和应激存活相关的转录本上调（SLC25A37、ACSM5、DHRS2、SQOR、BCL2A1、PDE2A、MCL1），而线粒体编码的电子传递链组分（MT-CYB、MT-CO3、MT-ATP6、MT-CO2、MT-ATP8、MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3和MT-ND4）强烈下调（图3B），表明OXPHOS严重受损。这种模式提示存活通路的激活与能量产生受损同时发生，与基质蛋白毒性应激一致。相比之下，AD-UPRmt-IMS主要抑制参与复合体I组装、核糖体稳定性和抗氧化防御的基因（NDUFB10、NDUFAF8、ENDOG、CHCHD10、MRPL41、NDUFA3、MRPL54、GPX1），没有代偿性转录上调的证据（图3C），表明对氧化应激的易感性增加。直接比较显示AD-UPRmt-MM与AD-UPRmt-IMS之间的转录差异有限，提示在严重应激下线粒体功能受到趋同抑制（补充图S3A）。总体而言，这些数据表明APP表达和区室特异性应激都能重塑线粒体基因表达，但通过不同的机制。AD样细胞增强线粒体翻译机制，而基质靶向的线粒体应激（AD-UPRmt-MM）诱导严重的OXPHOS抑制同时激活存活信号。相比之下，AD-UPRmt-IMS主要损害核糖体完整性和抗氧化能力。这些发现突出了可能导致AD相关神经退行性的区室特异性线粒体脆弱性。接下来，我们评估了UPRmt相关信号通路和线粒体应激应答，热图分析揭示了经典UPRmt相关基因的不同表达谱（图3D）。AD样细胞显著诱导UPRmt感受器（ATF5、ATF4、GDF15、HSF1）和MM蛋白质稳态基因（TOMM40、LONP1、TRAP1、CLPP），表明MM特异性UPRmt相关通路的强烈激活（图3E；补充图S3B）。这些基因编码参与蛋白质导入（TOMM40）、蛋白降解（LONP1、CLPP）和分子伴侣介导的折叠（TRAP1）的关键组分，提示APP应激下线粒体质量控制增强。然而，UPRmt-MM和UPRmt-IMS均显著降低这些基因的表达，表明APP相关的UPRmt相关转录应答受到抑制。IMS相关应激基因（HTRA2、CYCS、CYC1、COX17、COX19）在AD样条件下表现出中等程度的诱导，但在两种UPRmt-MM和UPRmt-IMS应激下均受到抑制（图3F），提示IMS蛋白质稳态受损。综合来看，这些发现表明区室特异性蛋白毒性应激破坏适应性线粒体应激应答程序和UPRmt相关信号，从而加重AD样小胶质细胞中的线粒体功能障碍。区室特异性线粒体应激在AD样细胞中破坏线粒体能量代谢和网络结构为评估线粒体功能，我们测量了不同应激条件下的耗氧率（OCR）（图4A；补充图S4A）。与WT相比，AD样细胞的基底呼吸、ATP相关呼吸和最大呼吸均显著降低，在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下进一步降低。这些结果表明，APP驱动的应激损害了线粒体能量产生，而区室特异性蛋白毒性应激进一步加剧了这一损害。RNA-seq分析证实了这些发现，揭示在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下，编码呼吸链复合体的基因发生下调，包括复合体I（MT-ND1–MT-ND6）、复合体II（SDHA、SDHB、SDHD、SDHAF1/2）、复合体III（MT-CYB、CYCS、UQCR亚基）和复合体IV（MT-CO1–MT-CO3、COX亚基）（补充图S4B）。综合来看，这些数据表明线粒体应激损害了核心能量代谢通路。图4：在APPswe/F/L表达和区室特异性线粒体应激下线粒体功能和结构受损。全尺寸图像A 耗氧率（OCR；pmol/min）定量，包括基底呼吸、ATP相关呼吸和最大呼吸能力，使用CyQUANT根据核DNA含量进行归一化。每个数据点代表n = 3生物学重复的归一化OCR值。B 用TMRM染色的线粒体代表性共聚焦图像。C 作为线粒体膜电位指标的TMRM荧光强度定量。每个数据点代表n = 3生物学重复每幅图像的归一化TMRM强度。D 由TMRM染色线粒体生成的代表性骨架化图像，展示结构变化和网络形态。标尺 = 20 μm。E–I 来自n = 3独立生物学重复的线粒体形态定量分析，包括：E 每个线粒体的分支数、F 总分支长度、G 每个线粒体的总分支长度、H 平均长宽比、I 每个线粒体的分支连接点。J、K 属于经过整理的线粒体生物发生和线粒体自噬/自噬通路的差异表达基因热图（FDR < 0.05，|Log?FC| ≥ 1）：J 线粒体生物发生基因和K 线粒体自噬/自噬基因。条形图代表生物学重复间（每种条件n = 3生物学重复）的均值 ± SEM；FDR/校正p < 0.05且Log?FC ≥ 1。统计学显著性以星号表示：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001（来自DESeq2的校正p或带有Tukey事后校正的单因素ANOVA，如方法部分所述）。通过四甲基罗丹明甲基酯（TMRM）染色评估的线粒体膜电位（Δψm）在AD样细胞中相比WT显著降低，在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下进一步降低，表明线粒体功能障碍加剧（图4B、C）。Δψm丧失反映了维持ATP合成所需的质子梯度受损。我们接下来使用定量形态学参数分析线粒体网络结构（图4D–I）。线粒体形态反映细胞的代谢状态和质量控制，分支和连接性的变化表明融合-分裂动力学发生改变38,39,40。与WT相比，AD样细胞表现出显著的线粒体分支减少，AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS进一步降低了分支数和连接点，提示连接性受损和碎片化（图4E、I）。总分支长度在AD样细胞中降低，但在UPRmt条件下增加，提示向融合方向发生代偿性转变41（图4F）。WT与AD细胞之间每个线粒体的平均分支长度没有显著差异；然而，在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下显著降低（图4G）。线粒体网络内总分支长度的减少反映了碎片化，其中线粒体变得更短、更球形且连接性更差。长宽比保持不变（图4H），而AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下分支连接点相比AD样细胞减少（图4I），提示向分裂转变和网络连接性降低。综合来看，这些结构变化表明区室特异性应激加剧了AD诱导的线粒体碎片化。转录组分析进一步支持了这些观察结果（图4J、K；补充图S4C）。调节线粒体生物发生的基因（TFAM、SIRT1、PRKAA1、MEF2D）在AD样细胞中下调，在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下进一步降低（图4J）。相反，线粒体自噬和线粒体动力学相关基因（BECN1、ULK1、PINK1、BNIP3、MFN2、FIS1）上调，提示线粒体质量控制通路的激活。然而，这种互补模式提示线粒体周转失调而非有效代偿（图4K；补充图S4C）。为在蛋白水平验证这些发现，我们通过Western blot评估了代表性的线粒体呼吸复合体。复合体I（NDUFS1）、复合体II（SDHA）、复合体III（UQCRC1）、复合体IV（CYTC）和复合体V（ATP5A1）的代表性亚基在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下均显著降低（补充图S4D、E）。这种减少与转录组变化高度平行，表明mRNA与蛋白表达一致。这些数据表明，区室特异性线粒体应激与呼吸链组分的协调减少相关，而非选择性重塑。总体而言，区室特异性线粒体应激加剧了AD样细胞中的线粒体功能障碍，导致能量代谢受损、线粒体网络碎片化和质量控制失调。这些合并缺陷突显了AD相关应激下线粒体稳态的一个关键脆弱性。MM特异性线粒体应激加剧AD样细胞中线粒体ROS、细胞死亡和淀粉样蛋白通路失调AD样细胞中的区室特异性线粒体应激与线粒体结构、膜电位和线粒体动力学的改变相关。因此我们接下来评估线粒体ROS产生和细胞死亡，这两个与AD病理相关的关键过程。通过共聚焦显微镜使用MitoBright Deep Red检测的线粒体ROS在AD样细胞中相比WT显著增加。AD-UPRmt-MM进一步增加了ROS水平，而AD-UPRmt-IMS没有显著的额外效应，表明MM特异性应激对线粒体氧化还原平衡的影响更为强烈（图5A、B）。为评估这些线粒体损伤是否增加细胞死亡易感性，我们进行了基于SYTOX Green的膜破裂实验。AD样细胞相比WT表现出增加的细胞死亡，而AD-UPRmt-MM条件进一步放大了这一效应。

相比之下，AD-UPRmt-IMS条件与AD样细胞相比未显著改变细胞死亡，表明线粒体基质（MM）特异性应激在此背景下优先调控细胞死亡通路（图5C）。使用野生型OTC和IMS-Fluc构建体（ADMM-WT和ADIMS-WT）进行的对照实验显示对细胞死亡无显著影响，证实了OTC-Δ介导响应的特异性（补充图S5A）。RNA-seq分析支持了这些发现。参与ROS解毒的基因，包括线粒体抗氧化酶（PRDX3/5、GPX1/4、TXN1），在AD样细胞中下调，而在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下进一步减少。PPARGC1A表达降低表明氧化还原缓冲功能受损（图5D）。细胞死亡通路基因（CASP1、RIPK1、BCL2L1、CASP8、TRADD、MLKL、CASP9）在AD-UPRmt-MM条件下显著上调，与多种细胞死亡程序的激活一致（图5E）。同样，炎症信号基因（RELA、IL6、JAK2、NFKB1、IKBKB、IL1B、STAT3、MYD88、NLRP3、TNF）在AD-UPRmt-MM条件下显著上调，表明NF-κB、JAK/STAT和NLRP3炎症小体通路的强烈激活（图5F）。综合这些发现，MM特异性应激放大了线粒体功能障碍、氧化应激和炎症性细胞死亡通路。图5：APPswe/F/L表达和区室特异性线粒体应激通过炎症和应激通路增加ROS和细胞死亡。全尺寸图像A、B使用MitoBright Deep Red检测线粒体ROS的代表性共聚焦图像及相应的荧光强度定量。C使用SYTOX Green基检测法在各条件下（WT、AD、AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS）对质膜完整性的定量。D–F与线粒体应激和细胞命运相关通路的RNA-seq数据热图：D ROS解毒基因，E 细胞死亡通路基因，F 炎症信号基因。柱状图代表生物学重复（每条件n = 3）的均值±标准误；FDR/校正后p < 0.05且Log?FC ≥ 1。显著性以星号表示：*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001（DESeq2或单向ANOVA配合Tukey事后校正的调整后p值，如方法部分所述）。为评估淀粉样蛋白处理，我们使用ELISA测量了胞外Aβ1–42水平。与WT相比，AD样细胞中的胞外Aβ1–42水平升高，且在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下保持相似的高水平（补充图5B）。RNA-seq数据提示AD相关基因（APP、LRP1、PSEN2、APH1A、CLU、BACE2和TREM2）在AD样细胞中的表达较WT升高。然而，APP处理基因在AD-UPRmt-MM和AD-UPRmt-IMS条件下呈现差异调控，表明其效应具有情境依赖性（补充图5C）。这些发现提示线粒体应激并不均匀调控淀粉样蛋白处理，而是差异性调节特定通路组分。尽管Aβ持续升高，但相关转录变化呈异质性，这可能有助于AD进展的变异性。ATF5敲低可挽救AD样细胞中的线粒体功能障碍、膜破裂和Aβ水平鉴于UPRmt相关信号和区室特异性线粒体应激加剧了AD小胶质细胞中的线粒体功能障碍和细胞死亡表型，我们接下来评估靶向抑制该通路是否能逆转这些缺陷。为选择性抑制UPRmt通路，我们靶向其主调控转录因子ATF5，这是哺乳动物线粒体未折叠蛋白反应中公认的介导因子。ATF5的功能类似于秀丽隐杆线虫中的ATFS-1，对经典UPRmt基因（包括HSP60、LONP1和CLPP）的转录诱导是必需的42,43。野生型和AD样小胶质细胞被转染人ATF5-siRNA，并通过RT-qPCR确认敲低效率。ATF5转录本水平降低约80–90%，表明UPRmt信号被强烈抑制（图6A）。功能检测显示，ATF5敲低显著挽救了与AD样应激相关的关键病理特征。基于SYTOX的膜破裂检测显示，ATF5 siRNA转染的AD样小胶质细胞中膜破裂和细胞死亡显著减少，表明细胞完整性改善（图6B）。平行地，通过ELISA定量的胞外Aβ1–42水平在ATF5沉默的AD样细胞中较对照组显著降低，提示胞外Aβ积累减少（图6C）。为确定抑制ATF5依赖性UPRmt信号是否恢复线粒体功能，我们评估了线粒体膜电位和ROS产生。TMRM荧光显示，与对照组相比，ATF5-siRNA转染的AD样小胶质细胞中线粒体膜电位明显恢复（图6D、E）。平行地，MitoSOX Red测量显示ATF5敲低后线粒体ROS水平显著降低（图6F、G）。总之，这些发现表明抑制ATF5依赖性UPRmt信号可减轻线粒体功能障碍、减少氧化应激，并限制细胞死亡和Aβ积累。这些结果支持了在AD样小胶质细胞中慢性APP相关应激条件下，持续性ATF5依赖性UPRmt信号发挥不良适应作用的观点。图6：ATF5-siRNA介导的敲低减少AD样小胶质细胞中的细胞死亡，防止Aβ积累并挽救线粒体功能障碍。全尺寸图像A WT和AD细胞中ATF5-siRNA介导敲低的RT-qPCR验证，来自3个独立生物学重复。B 使用SYTOX Green基检测法在各条件下对质膜完整性的定量：WT（对照siRNA）、WT（ATF5-siRNA）、AD（对照siRNA）和AD（ATF5-siRNA），来自3个独立生物学重复。C 通过夹心ELISA定量WT和AD条件下转染ATF5-siRNA的Aβ1–42水平，来自4个独立生物学重复。D、E 使用TMRM染色线粒体的代表性共聚焦图像及相应的TMRM荧光强度定量，作为线粒体膜电位的指标。每个数据点代表n = 3个独立生物学重复中每张图片的平均强度。F、G 使用MitoBright Deep Red检测线粒体ROS的代表性共聚焦图像及相应的荧光强度定量。每个数据点代表n = 3个独立生物学重复中每张图片的平均强度。数据代表独立生物学重复的标准误。显著性以星号表示：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001（单向ANOVA配合Tukey事后校正，如方法部分所述）。讨论线粒体功能障碍是公认的AD标志，驱动能量代谢受损、氧化应激和神经元退化44,45。UPRmt被认为是通过激活分子伴侣、蛋白酶和应激反应调节因子来维持蛋白质稳态的一种代偿机制46。与此一致的是，线粒体应激标志物（包括ATF4、ATF5、CHOP、LONP1和CLPP）的升高已在患者样本及动物和细胞模型中被报告，部分与疾病严重程度相关47，从而支持了UPRmt激活在蛋白质毒性应激反应中的保守作用15。我们的发现与这些观察一致，表明APPswe/F/L表达激活线粒体应激通路和核糖体生物合成，同时抑制突触和脂质信号，反映了早期AD相关的细胞重塑37。先前的研究也显示Aβ15,16,17,18和过度磷酸化tau19可激活UPRmt，在AD模型和患者大脑中观察到UPRmt相关基因表达增加15。实验模型进一步表明UPRmt的调控可影响Aβ病理，强调其在AD中的功能相关性16,17。综合这些发现，突显了UPRmt在AD中的核心作用，同时强调其功能结局——是保护性还是不良适应性的——仍有待解决。在本研究中，我们表明针对基质（matrix）和基质内膜空间（IMS）靶向的线粒体应激的细胞反应具有高度情境依赖性，并由线粒体区室特异性所决定。基质靶向应激（UPRmt-MM）和IMS靶向应激（UPRmt-IMS）产生不同的转录和功能结局。MM特异性应激诱导强烈的免疫激活和呼吸链（OXPHOS）的显著抑制，而IMS特异性应激主要破坏线粒体核糖体完整性和抗氧化防御，同时激活干扰素信号。这些发现提示线粒体应激反应是区室特异性的而非均匀的，为AD中UPRmt相关信号增加了新的复杂性。与此一致的是，转录组和功能分析显示区室特异性应激以不同方式重塑线粒体和免疫通路。MM应激驱动呼吸链组分和ATP合成的抑制以及炎症和干扰素通路的激活，符合代谢受损、促炎状态。相比之下，IMS应激诱导翻译减弱和抗病毒信号，对核心生物能量学的影响相对较温和。这些特征与人类AD数据集一致，后者将线粒体功能障碍和干扰素应答型小胶质细胞与疾病进展联系起来48。本研究识别的多种应激应答基因，包括ATF4、ATF5、GDF15以及蛋白质稳态调节因子（LONP1、CLPP、YME1L1、HTRA2），突显了潜在的生物标志物和治疗靶点49。MM应激下线粒体编码的OXPHOS基因显著下调表明呼吸链功能严重受损，可能导致ATP产生减少和线粒体ROS升高，与AD中报道的早期生物能量缺陷一致50,51。相比之下，IMS应激优先激活干扰素应答基因，反映了由线粒体应激信号触发的先天免疫通路的参与34,35。两种应激条件均破坏线粒体结构，与AD相关的线粒体碎裂、嵴紊乱和网络连通性降低一致52,53,54。综合这些发现，AD中的线粒体功能障碍反映了生物能量、结构和免疫调控系统的整合性失败，其中线粒体基质是一个特别脆弱的区室。重要的是，我们的ATF5功能缺失实验提供了功能证据，表明持续性ATF5依赖性UPRmt信号有助于AD样小胶质细胞中的线粒体功能障碍。ATF5敲低恢复线粒体膜电位、减少线粒体ROS并降低细胞死亡，表明关键病理特征的逆转。此外，抑制ATF5降低胞外Aβ水平，建立了线粒体应激信号与淀粉样蛋白处理之间的功能联系。这些发现证明，在慢性APP相关应激条件下，持续性ATF5依赖性UPRmt信号通路的激活可以变为不良适应性反应。与先前的相关性研究不同，我们的数据提供了直接证据，表明靶向抑制ATF5依赖性UPRmt信号可部分挽救线粒体和细胞功能障碍，支持失调的UPRmt相关信号在AD中的因果关系。综合而言，这些结果支持这样一个模型：淀粉样蛋白病理使小胶质细胞对应力敏感性升高，而基质和IMS靶向的线粒体应激驱动不同的不良适应反应，其中MM应激促进生物能量崩溃和炎症，IMS应激则倾向于抗病毒和蛋白质稳态相关信号。本研究存在若干局限性。首先，实验在永生化小胶质样细胞中进行，可能无法完全反映体内小胶质细胞状态的复杂性或神经-胶质细胞相互作用。其次，本研究中使用的OTC-Δ和IMS-Fluc-DM-mut构建体是诱导线粒体蛋白质毒性应激和探究区室特异性UPRmt信号的工具；然而，它们不能完全重现体内的内源性UPRmt激活。相反，它们提供了一个受控框架，用于研究AD相关的线粒体应激如何与基质和IMS特异性蛋白质稳态通路相互作用。此外，虽然转录组分析提供了关键见解，但在蛋白和功能水平上的进一步验证，特别是在患者来源和体内系统中，将是必需的。未来的研究应通过引入体内模型、患者来源细胞和纵向分析来解决这些局限性，以定义调控区室特异性线粒体应激反应和UPRmt相关信号的治疗窗口。虽然神经元的线粒体功能障碍在AD中已被充分证实，但我们对小胶质细胞的关注反映了其在神经炎症、免疫调节和病理性聚集体清除中的核心作用，这些过程与线粒体功能紧密相关。尽管小胶质细胞UPRmt的直接体内证据仍然有限，但来自人类iPSC基础和类器官模型的新兴数据支持其相关性55。这些发现提供了一个将小胶质细胞线粒体应激反应与AD进展联系起来的机制框架。总之，我们的研究表明AD中线粒体应激反应是区室特异性的而非均匀的，MM和IMS中出现不同的应激反应。APPswe/F/L表达激活线粒体应激通路，而靶向蛋白质毒性应激以区室依赖性方式放大这些反应，其中MM应激驱动免疫激活和生物能量崩溃，IMS应激损害翻译和抗氧化防御。重要的是，通过ATF5敲低抑制ATF5依赖性UPRmt信号可部分恢复线粒体功能并减少关键病理特征，支持失调的UPRmt相关信号的因果作用。综合而言，这些发现将区室特异性线粒体应激通路确定为小胶质细胞功能障碍的重要调节因子，并突显了线粒体蛋白质稳态和应激反应通路作为AD中有前景的治疗靶点。方法细胞培养使用人小胶质样细胞（HMC3，野生型）和稳定表达带有Swedish、Florida和London突变的淀粉样前体蛋白的HMC3细胞（HMC3-APPswe/F/L；AD样模型）31来研究区室特异性线粒体应激反应和UPRmt信号。HMC3细胞代表野生型小胶质样细胞，而HMC3-APPswe/F/L细胞模拟家族性AD相关的淀粉样蛋白应激。细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、1%非必需氨基酸（NEAA）和1 mM钠丙酮酸盐的最基本培养基（MEM）中培养。APPswe/F/L培养物在含有嘌呤霉素（2 μg/mL）的培养基中维持选择；在进行所有功能检测前移除嘌呤霉素以避免干扰细胞反应。培养物在含5% CO?的加湿培养箱中37°C培养。使用传代次数低于20的细胞以确保可重复性。质粒和转染为建立区室特异性线粒体蛋白质毒性应激，使用哺乳动物表达构建体：OTC（野生型对照，Addgene #71877）和OTC-Δ（缺失突变体，Addgene #71878）用于基质UPRmt（UPRmt-MM），IMS-Fluc-Flag（野生型对照，Vector Builder #VB221003-1243ust）和IMS-Fluc-DM-mut-Flag（双突变错误折叠构建体，Vector Builder #VB221003-1245bty）用于IMS UPRmt（UPRmt-IMS）。OTC-Δ构建体编码鸟氨酸转甲酰胺酶（ornithine transcarbamylase）的缺失突变体，该突变体在MM内错误折叠，此前已被验证为诱导基质相关线粒体蛋白质毒性应激和UPRmt-MM信号的工具32。

IMS-Fluc-DM-mut构建体编码一种易于错误折叠的双突变荧光素酶，通过HTRA2来源的靶向序列定位于IMS33，并已验证可作为IMS蛋白质稳态和线粒体应激的报告基因。转染使用FuGENE 4 K（Promega #E5911）按照制造商的方案进行。24小时后，用新鲜培养基替换转染培养基以减少细胞毒性。细胞要么铺板用于下游实验，要么保留在原培养容器中。所有实验均在转染后48小时进行，以确保转基因的最佳表达。分析了四种实验条件：HMC3-WT（WT）、HMC3-APPswe/F/L（AD）、HMC3-APPswe/F/L-OTC-Δ（AD-UPRmt-MM）和HMC3-APPswe/F/L-IMS-Fluc-DM-mut（AD-UPRmt-IMS）。为敲低ATF5水平，使用人ATF5 siRNA（Santa Cruz #sc-43580），并通过Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen #13778-150）按照制造商的方案进行转染。分析了四种实验条件：WT对照-siRNA、WT-ATF5-siRNA、AD对照-siRNA和AD-ATF5-siRNA。免疫荧光与激光共聚焦显微镜：转染前24小时，以每35毫米玻璃底培养皿（MatTek, #PG35GC-1.5-14-C）1.0×10?个细胞的密度铺板。如上所述，细胞与OTC-Δ或IMS-Fluc-DM-mut构建体转染。转染后48小时，细胞固定并分别与ATP5A1（Proteintech, #66037-1-Ig; 1:300）、OTC（Antibodies.com, #A39145; 1:150）和FLAG（Proteintech, #20543-1-AP; 1:800）抗体进行免疫染色。二抗包括用于检测ATP5A1的山羊抗小鼠Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific, #A32723TR; 1:1000）和用于检测OTC及FLAG的山羊抗兔Alexa Fluor 594（Thermo Fisher Scientific, #A11037; 1:1000）。用DAPI（Thermo Fisher Scientific, #62248）对细胞核进行复染。共聚焦成像在Olympus FV4000上使用60倍物镜进行。使用Wiemer颜色解卷积法对所有组的图像进行统一的锐化处理。定量分析时，沿每个线粒体纤维的纵向绘制一条线进行追踪，提取并绘制荧光线强度曲线。Pearson相关系数在ImageJ（NIH）中计算并绘制。RNA提取与qRT-PCR：使用RNeasy Mini Kit（Qiagen #74104）提取总RNA，并使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）进行逆转录。qRT-PCR使用PowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）进行，以RPS13作为内参基因。使用2^-ΔΔCt法计算相对表达量，并以HMC3-WT对照进行归一化。引物序列见补充表1。RNA测序：每个条件进行4个生物学重复的RNA-seq实验，采用Illumina TruSeq Stranded mRNA方案。文库在Illumina NovaSeq 6000平台上测序，生成长度为150 bp的配对末端读长，平均测序深度约为每个样本4800万条读长。RNA完整性已确认（RIN ≥ 8）。质量控制与预处理：使用FastQC（v0.11.9）对原始测序读长进行质量评估，评估参数包括碱基质量分数、GC含量和序列重复水平。使用Trimmomatic（v0.39）去除接头序列和低质量读长，应用标准丢弃含有超过10%未确定碱基（N）或超过50%碱基的Phred质量分数≤5的读长。修剪后保留的清洁读长用于下游分析，并计算测序质量指标，包括Q20和Q30分数（超过95%的碱基超过Phred分数30）、GC含量（45-55%）以及总体错误率。比对率超过95%，确保证据质量足以支持下游分析。比对与定量：使用STAR（v2.7.10a）以两步模式将清洁读长比对到人参考基因组（GRCh38）上，以改善剪接位点检测和比对准确性。HISAT2（v2.2.1）也用于剪接感知比对以验证剪接位点。使用featureCounts（v2.0.1）获得基因水平计数值。用于可视化的表达值归一化为FPKM（每千碱基转录本每百万比对读长片段数），而原始计数值用于差异表达分析，这是DESeq2工作流程的推荐方法。差异表达分析：在R（v4.3）中使用DESeq2（v1.38）鉴定差异表达基因，采用Benjamini-Hochberg方法进行错误发现率（FDR）校正，显著性阈值设定为FDR < 0.05且绝对log?倍变≥1。使用Morpheus（Broad Institute）对log?(FPKM+1)值进行层次聚类分析和主成分分析（PCA）。功能富集：进行功能富集分析以鉴定差异表达基因所代表的生物学过程、通路和疾病关联。基因本体（GO）分析用于将基因分类为生物学过程、分子功能和细胞组分，KEGG通路分析实现了通路水平的注释。基因集富集分析（GSEA）用于评估预定义基因集的富集情况。使用Reactome进行额外的通路解释。使用人类疾病本体论和DisGeNET平台评估疾病相关富集，这些平台提供将基因与人类疾病关联的结构化注释。Western blotting：细胞在1× RIPA裂解缓冲液（补充SIGMAFAST?蛋白酶抑制剂混合物）中裂解，然后在4°C离心30分钟。使用Bio-Rad法在660 nm处测定蛋白浓度。将等量蛋白质通过SDS-PAGE分离并转至PVDF Immobilon-FL膜（EMD Millipore, #IPFL00010）上。膜在封育缓冲液（Rockland, #MB-070）中室温封闭2小时，然后在4°C下与一抗孵育过夜。使用以下一抗：ATF4（Cell Signaling and Technology, #11815S; 1:1000）、CHOP（Proteintech, 15204-1-AP; 1:1000）、ATF5（Proteintech, #67066-1-Ig; 1:1000）、HSF1（Cell Signaling and Technology, #51034-1-AP; 1:1000）、DELE1（Cell Signaling and Technology, #98271; 1:1000）、p-eIF2α（Cell Signaling and Technology, #3398S; 1:1000）、eIF2α（Invitrogen, #AHO-0802; 1:1000）、p-HSF1（Invitrogen, #PA5-101018; 1:1000）、NDUFS1（Proteintech, #12444-1-AP; 1:1000）、SDHA（Abcam, #ab147151; 1:1000）、UQCRC1（Proteintech, #21705-1-AP; 1:1000）、细胞色素c（CYCS）（Santa Cruz, #sc-13156 AF680; 1:1000）、ACTIN（Santa Cruz, #sc-8432 AF680; 1:1000）、GAPDH（Abcam, #AB18409S; 1:1000）、TOM20（Abcam, #ab56783; 1:1000）、FLAG（Proteintech, #F1804; 1:1000）和ATP5A1（Proteintech, #66037-1-Ig; 1:1000）。一抗孵育后，膜用TBS-T（0.1% Tween-20）洗三次，每次10分钟，然后与IR680或IR800二抗在室温下孵育2小时。使用Bio-Rad ChemiDoc系统进行成像。条带强度在ImageJ（NIH）中定量，进行背景扣除，并以GAPDH和ACTIN进行归一化。全长blot见补充图S6。线粒体分离与亚分级：HMC3-WT细胞在150毫米培养皿中培养，用OTC-Δ和IMS-Fluc-Flag构建体转染，随后收集细胞沉淀用于线粒体分离。将细胞沉淀重悬于等渗线粒体分离缓冲液（MIB：200 mM甘露醇、70 mM蔗糖、10 mM HEPES、1 mM EGTA、蛋白酶抑制剂；pH 7.5）中，体积为沉淀体积的5倍，并在冰上孵育10分钟。使用Dounce匀浆器匀浆细胞（先10次松紧冲程，再15次紧冲程），并保留100 μL作为全细胞裂解液。样品首先在4°C下以500×g离心10分钟以去除碎片，所得上清液在4°C下以12,000×g离心20分钟以获得粗线粒体，上清液保留为胞质组分。线粒体沉淀用分离缓冲液洗两次，然后进行去氧胆酸盐依赖性通透化处理，将等分样本（M1-M5）在室温下用定义的MIB、蛋白酶K、去氧胆酸盐或Triton X-100混合物孵育10分钟。通过加入2 μL 100 μM PMSF终止反应，然后在冰上孵育5分钟后在4°C下以12,000×g离心8分钟。沉淀重悬于含蛋白酶抑制剂和6× SDS加样缓冲液的MIB中，在95°C加热10分钟，分为三个等份用于SDS-PAGE。全细胞裂解液、胞质和线粒体组分（M1-M5）在100 V下电泳110分钟，并以100 V转膜60分钟。检测ATP5A1、GAPDH、FLAG、OTC和TOM20以评估线粒体完整性和亚室蛋白的可及性。ELISA定量细胞外Aβ肽：为确定区室特异性UPRmt是否影响Aβ通路，从所有实验组的培养上清液中定量细胞外Aβ肽（Aβ1-42）。在指定时间点收集上清液，使用Aβ特异性ELISA试剂盒（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, #298-62401用于Aβ1-42）按照制造商说明进行分析。简而言之，将100 μL标准品和样本加入预包被的96孔板中，在4°C下孵育过夜。洗涤去除未结合物后，将板与HRP偶联的检测抗体在4°C下孵育1小时。随后加入TMB底物溶液并在室温下孵育30分钟以显色。加入终止液终止反应，并在450 nm处用酶标仪测量吸光度。Aβ肽浓度根据每个实验生成的标准曲线计算。SYTOX Green膜完整性检测：使用SYTOX Green核酸染料（Thermo Fisher Scientific, #S7020）评估质膜完整性，该染料可选择性穿透膜受损的细胞并结合DNA，导致死细胞或受损细胞荧光增强。在96孔板中每组每孔铺入等量细胞（2×10?个），随后在37°C下用SYTOX Green（1 μM）孵育1小时。使用酶标仪在激发/发射波长504/530 nm处测量荧光。为按细胞数和DNA含量归一化，直接加入CyQUANT试剂（Promega, #C35011）至含完全培养基的孔中，避光孵育30分钟。CyQUANT的荧光在激发/发射波长508/527 nm处记录。数据以SYTOX Green荧光按DNA含量归一化表示。Seahorse XF氧消耗率测定：使用XF96细胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience）在37°C下测量线粒体呼吸作用。所有组的细胞以每孔2×10?个细胞的密度铺入XF96板中，在实验前培养24小时。用含有25 mM葡萄糖、25 mM GlutaMAX和1 mM丙酮酸钠的Seahorse XF实验培养基（pH 7.4）替换培养基，在CO?孵育器外平衡1小时。在基础条件下记录OCR，并依次注射寡霉素（2 μM；ATP合酶抑制剂）、FCCP（2 μM；线粒体解偶联剂）和鱼藤酮/抗霉素A（各0.5 μM；复合物I和III抑制剂）。这些药物用于解析线粒体功能：寡霉素用于ATP相关呼吸，FCCP用于最大呼吸能力，鱼藤酮/抗霉素A用于非线粒体呼吸。从这些测量中计算以下参数：基础呼吸、ATP相关呼吸和经非线粒体呼吸校正的最大呼吸能力。使用CyQUANT试剂（Promega）进行OCR值归一化，避光孵育30分钟，并用酶标仪在508/527 nm处测量荧光。数据以OCR按DNA含量（CyQUANT信号）归一化表示，使用Seahorse Wave软件。线粒体ROS生成评估：使用MitoBright Deep Red（Dojindo Molecular Technologies, #MT16-12）测量线粒体超氧化物生成，这是一种荧光染料，可选择性靶向线粒体，被超氧化物氧化后呈现红色荧光。所有实验组以每孔2×10?个细胞铺入35毫米培养皿中。用MitoBright Deep Red孵育后，使用FV4000共聚焦显微镜在60倍放大下进行活细胞成像。用Hoechst（Thermo Fisher Scientific, #62249）对细胞核进行复染。使用ImageJ软件定量每个细胞的MitoBright荧光强度。每组采集50张图像，来自n=3次独立实验，荧光强度按Hoechst染色细胞核数量归一化，并以相对于HMC3-WT对照的倍数变化表示。数据点代表三次独立实验中每张图像经Hoechst归一化后的荧光强度。线粒体膜电位成像检测：使用TMRM（100 nM；Thermo Fisher Scientific, #T668）评估线粒体膜电位，这是一种电位染料，会积累在活性线粒体中。所有实验组的细胞以每35毫米光学底培养皿1×10?个细胞铺板，在相同条件下培养。在37°C孵育30分钟后，使用FV4000共聚焦显微镜在60倍放大下进行活细胞成像。使用ImageJ软件对每个细胞的平均TMRM信号进行荧光强度定量，对所有样品应用一致的阈值和背景扣除。分析来自n=3次独立实验的约300个细胞（每组50张图像），荧光强度按Hoechst染色细胞核归一化，并以相对于HMC3-WT对照的倍数变化表示。数据点代表独立实验中每张图像经Hoechst归一化后的荧光强度。统计分析：数据以至少n=3次独立生物学实验的均值±标准误（SEM）表示。统计检验包括两组比较的双尾Student's t检验、多组比较的单因素方差分析和多因素分析的双因素方差分析加Tukey事后检验。p < 0.05被认为具有统计学显著性，对应95%置信区间。每个数据集使用的具体统计方法在相应图注中有详细说明。分析使用GraphPad Prism v10.0进行。