通过全基因组CRISPRi筛选技术发现调节干扰素反应性小胶质细胞的因子

《npj Dementia》：Regulators of interferon-responsive microglia uncovered by Genome-wide CRISPRi screening

　　**摘要**
小胶质细胞通过响应损伤或疾病而诱导特定的活化状态，动态地支持大脑健康。在神经发育窗口期、与年龄相关的认知衰退以及神经退行性疾病中，都观察到了干扰素反应性小胶质细胞（IRM）的活化现象。功能上，IRM与突触修剪、死亡细胞清除和神经炎症有关，这使得这种状态对大脑稳态至关重要。尽管这种状态的功能重要性日益明显，但我们对其调控网络的理解仍然不完全。为了系统地识别IRM状态的遗传调节因子，我们使用IFIT1作为代表性的IRM标记，在人类iPSC来源的小胶质细胞中进行了全基因组CRISPR干扰筛选。我们发现了772个调节IRM的基因，包括典型的I型干扰素信号通路基因（IFNAR2、TYK2、STAT1/2、USP18）以及新发现的调节因子。我们还揭示了CCR4-NOT转录复合体亚基10（CNOT10）在IRM活化中的非典型作用。这项工作提供了一个全面的资源，可用于剖析干扰素反应性小胶质细胞的功能，并突出了在健康和疾病状态下调节小胶质细胞干扰素信号通路的已知和新型靶点。

**引言**
小胶质细胞是动态的免疫细胞，持续监测脑实质以维持大脑健康。在受到损伤或刺激时，小胶质细胞会迅速触发转录活化程序以恢复稳态。传统的观点认为这些免疫反应仅仅是针对病理状态的响应，然而过去十年的研究表明，小胶质细胞的活化在许多发育和神经退行性疾病中起到了疾病修饰的作用。一种对大脑健康有明显功能影响的小胶质细胞活化状态是干扰素反应性小胶质细胞（IRM）状态。IRM的特点是高表达干扰素刺激基因（ISGs），并与清除死亡细胞和减少神经元突触相关。ISGs的表达最初被认为是宿主对抗病毒颗粒的机制。然而，即使在没有病毒感染的情况下，也发现小胶质细胞能够强烈诱导ISGs的产生。诱导ISGs的核酸识别途径可以被微小RNA、线粒体DNA的泄漏或进入细胞质的LINE元件触发。此外，其他细胞类型和组织（如T细胞或脉络丛）产生的IFN的旁分泌信号也能触发IRM的活化。在发育过程中，IRM在突触精细化中起着关键作用。在自闭症谱系障碍（ASD）患者以及模拟ASD新生突变的体外实验中，检测到IRM水平升高。在正常发育过程中，IRM的活化受到严格的时间调控，并不会持续到健康的成年期。有趣的是，在衰老的大脑中，IRM会再次扩张。年轻与衰老小胶质细胞中差异表达的基因中，超过一半与I型干扰素反应相关。此外，在最近建立的大脑衰老时钟模型中，几乎所有脑细胞类型在衰老大脑中都显示出强烈的干扰素反应特征，这被认为与衰老相关的认知衰退有关。此外，IRM在包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病中也显著富集。尽管在衰老和疾病数据集中都检测到了IRM，但目前尚不清楚IRM是代表一种有益的活化程序（有助于对抗衰老和疾病表型），还是具有适应不良性并促进疾病进展。IRM的影响可能因疾病、病理状态和时间而异。现有证据表明，大脑中增强的干扰素信号传导会增强小胶质细胞的吞噬作用，可能导致异常的突触修剪，从而引发类似痴呆的症状。使用缺乏I型干扰素受体（IFNAR1）的转基因小鼠、抗IFNAR抗体或cGAS-STING抑制剂阻断干扰素反应，在正常衰老背景下以及由淀粉样蛋白或tau蛋白驱动的阿尔茨海默病模型和帕金森病模型中，均显示出减缓认知衰退的效果。然而，IFNβ和IRM并不总是有害的。例如，IFNβ已被用于治疗多发性硬化症患者。在多发性硬化症的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，通过ganciclovir治疗激活小胶质细胞的干扰素反应被证明具有治疗作用。同样，在帕金森病模型中，IFNβ刺激促进了有益的小胶质细胞功能，包括α-突触核蛋白的吞噬作用和自噬通量的增加。

**方法**
为了系统地识别干扰素反应性小胶质细胞的遗传调节因子，我们在人类iPSC来源的小胶质细胞中进行了全基因组CRISPR干扰筛选，以IFIT1作为代表性的IRM标记。我们鉴定了772个调节IRM的基因，包括典型的I型干扰素信号通路基因（IFNAR2、TYK2、STAT1/2、USP18）以及新发现的调节因子。我们还揭示了CCR4-NOT转录复合体亚基10（CNOT10）在IRM活化中的非典型作用。

**结果**
通过iPS-Microglia中干扰素反应基因的鉴定，我们能够在诱导多能干细胞衍生的小胶质细胞（iPS-Microglia）中进行基于CRISPR的全基因组筛选。首先，我们通过批量RNA测序鉴定出对IFNβ有响应的转录本。我们用低浓度（10 pM）或高浓度（100 pM）的IFNβ处理iPS-Microglia（图1A、B，补充图1，补充数据1）。尽管100 pM处理的效应大小大于10 pM处理，但我们发现这两种处理浓度下的差异表达基因（DEGs）之间存在显著的相关性（R2 = 0.93）（补充图1）。

**结论**
小胶质细胞是动态的免疫细胞，持续监测脑实质以维持大脑健康。在受到损伤或刺激时，小胶质细胞会迅速触发转录活化程序以恢复稳态。虽然这些免疫反应传统上被认为是对病理状态的响应，但过去十年的研究表明，小胶质细胞的活化在许多发育和神经退行性疾病过程中起着疾病修饰的作用。一种对大脑健康有明显功能影响的小胶质细胞活化状态是干扰素反应性小胶质细胞（IRM）状态。IRM的特点是高表达干扰素刺激基因（ISGs），并与清除死亡细胞和减少神经元突触相关。ISGs的表达最初被认为是宿主防御病毒颗粒的机制。然而，即使在缺乏病毒感染的情况下，也发现小胶质细胞能够强烈诱导ISGs的产生。诱导ISGs的核酸识别途径可以被微小RNA、线粒体DNA的泄漏或进入细胞质的LINE元件触发。此外，其他细胞类型和组织（如T细胞或脉络丛）产生的IFN的旁分泌信号也能触发IRM的活化。在发育过程中，IRM在突触精细化中起着关键作用。在自闭症谱系障碍（ASD）患者和模拟ASD新生突变的体外实验中，检测到IRM水平升高。在正常发育过程中，IRM的活化在特定的发育窗口期内受到严格的时间调控，并不会持续到健康的成年期。有趣的是，在衰老的大脑中，IRM会再次扩张。年轻与衰老小胶质细胞中差异表达的基因中，超过一半与I型干扰素反应相关。此外，在最近建立的大脑衰老时钟模型中，几乎所有脑细胞类型在衰老大脑中都显示出强烈的干扰素反应特征，这被认为与衰老相关的认知衰退有关。此外，在包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病中，IRM也显著富集。

尽管在衰老和疾病数据集中都检测到了IRM，但目前仍不清楚IRM是代表一种有益的活化程序（有助于对抗衰老和疾病表型），还是具有适应不良性并促进疾病进展。IRM的影响可能因疾病、病理状态和时间而异。现有证据表明，大脑中增强的干扰素信号传导会增强小胶质细胞的吞噬作用，可能导致异常的突触修剪，从而引发类似痴呆的症状。使用缺乏I型干扰素受体（IFNAR1）的转基因小鼠、抗IFNAR抗体或降低IRM的cGAS-STING抑制剂，在正常衰老背景下以及由淀粉样蛋白或tau蛋白驱动的阿尔茨海默病模型和帕金森病模型中，均显示出减缓认知衰退的效果。然而，IFNβ和IRM并不总是有害的。例如，IFNβ已被用于治疗多发性硬化症患者。在多发性硬化症的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，通过ganciclovir治疗激活小胶质细胞的干扰素反应被证明具有治疗效果。同样，在帕金森病模型中，IFNβ刺激促进了有益的小胶质细胞功能，包括α-突触核蛋白的吞噬作用和自噬通量的增加。

综上所述，对发育、衰老和疾病过程中IRM的观察表明，其活化受到复杂的调控过程的影响。这促使我们使用全基因组CRISPR干扰筛选系统地评估IRM状态的遗传调节因子。我们发现了大量调节小胶质细胞进入IRM状态的典型干扰素信号通路调节因子和ISGs，确认了它们在小胶质细胞中的重要性。此外，我们还发现了IRM的新调节因子，包括CCR4-NOT去甲基化酶亚基CNOT10的非典型作用。由于出于治疗目的的IRM调节方向可能具有特异性，我们鉴定了IRM状态的抑制剂和激活剂。这些调节因子可用于选择性地干扰IRM，以确定这种活化状态在特定疾病背景下的功能，并可用于开发针对IRM状态相关疾病的疗法。非显著重叠区域显示为白色。*P<0.05，**P<0.01。IFIT1蛋白在IFNAR2敲低（蓝色）细胞与非argeting对照细胞（灰色）中的中位荧光强度（MFI）比较。在流式细胞术分析前24小时添加了10 pM的IFNβ。（n=3个独立孔，每个重复实验超过10,000个细胞。条形图代表平均值±标准误差，T检验）。J USP18敲低（红色）细胞与非targeting对照（灰色）细胞中的IFIT1蛋白中位荧光强度（MFI）比较，这些细胞被设置为孔内对照。在流式细胞术分析前24小时添加了10 pM的IFNβ。n=3个独立孔，每个重复实验超过10,000个细胞。条形图代表平均值±标准误差，配对T检验。K Deucravacitinib处理（蓝色）后IFIT1蛋白的中位荧光强度（MFI）与载体处理（灰色）细胞比较。在Deucravacitinib处理30分钟后，添加了10 pM的IFNβ，然后进行流式细胞术分析。n=3个独立孔，每个重复实验超过10,000个细胞。条形图代表平均值±标准误差，T检验。L MX1蛋白在敲低后的平均荧光强度与非targeting对照相比，经过DAPI核计数标准化。在流式细胞术分析前24小时添加了10 pM的IFNβ。n=3个独立孔，每个重复实验平均4张图像。条形图代表平均值±标准误差，ANOVA，Tukey多重比较检验。

我们对通过Reactome Pathways 2024库筛选出的所有IRM调节因子进行了基因集富集分析。我们发现与干扰素反应相关的通路显著富集，包括免疫系统中的细胞因子信号传导、IFNG信号传导的调节、IFNA/IFNB信号传导的调节、干扰素α/β信号传导以及干扰素α/β信号传导在IRM调节因子列表中（补充数据3）。值得注意的是，对于这些通路中的每一个，我们的筛选仅识别出了一部分预测的调节因子（补充数据3，图2D）。由于我们的筛选是一次只干扰一个基因，因此它倾向于发现单独作用时有效的调节因子。具有高度冗余性的调节因子无法通过这种筛选设计被发现。因此，这种方法也可以用于优先考虑具有治疗潜力的节点。

我们的基因集富集分析还揭示了与干扰素信号传导或病毒反应没有直接关联的通路富集。我们发现mRNA去腺苷化、PTEN稳定性和活性的调节以及与TP53相关的多个通路显著富集，包括TP53的转录调节、TP53调控细胞周期基因的转录以及p53依赖的G1 DNA损伤反应（补充数据3）。在我们的筛选中，TP53被确定为IRM的正向调节因子（敲低会降低IFIT1表达）。此前有研究将IFIT1指定为TP53的直接靶点38，尽管这一结果尚未在多个数据集中得到验证39。然而，其他IRM基因也被指定为TP53的靶点，包括IFIT3、MX2、OAS1、IFNAR2、TBK1、IRF1、IRF939。这进一步支持了我们的发现，即TP53可能调节IRM。

为了确定是否存在特定的转录因子能够共同驱动我们在筛选中发现的基因集，我们从TRRUST数据库进行了基因集富集分析。我们发现预测的STAT1和STAT2调控因子在负向命中中显著富集（TRRUST v2；FDR STAT1：0.0001，STAT2：0.0357）。我们的正向命中中预测的SP1和IRF2调控因子也显著富集（TRRUST v2；FDR SP1：0.0084，IRF2：0.0212）。

由于干扰素在外周系统中的调节作用已经是一个研究了几十年的领域，我们使用Google Gemini大型语言模型挖掘了现有研究，以确定我们的命中结果在多大程度上与干扰素信号传导有关。Google Gemini将我们的筛选结果分类为“典型的干扰素调节因子”，包括那些直接位于IFNβ下游的因子（图2C，用蓝色和灰色标记）、“报告中与干扰素相关”的基因（包括在干扰素和病毒反应基因本体术语中出现的基因），以及“新的干扰素调节因子”（Google Gemini未发现这些基因与干扰素反应有任何已知关联，图2E，补充数据4,5）。我们筛选中的大多数基因被归类为第三类新的干扰素调节因子。为了更好地理解我们筛选出的新的干扰素调节因子，我们仅对第三类的新基因集进行了基因集富集分析。我们发现与mRNA稳定性、细胞周期和代谢相关的多个Reactome通路显著富集（图2F，补充数据6）。我们还发现WikiPathways_Human_2024中的两种疾病通路——阿尔茨海默病（WP5124）和注意力缺陷多动障碍及自闭症谱系障碍（WP5420）的通路显著富集（图2F，补充数据6）。

为了更稳健地解释我们的IRM调节因子与阿尔茨海默病（AD）之间的关系，我们挖掘了Open Targets 40数据库，以确定我们的筛选结果在多大程度上与AD相关。Open Targets根据累积的证据为每个基因分配一个疾病评分，表明该基因与特定疾病的相关性。我们发现我们的IRM调节因子的AD基因评分显著高于非命中基因（Mann-Whitney U检验P值为7.5×10^-154）。我们将Open Targets的疾病评分进一步分为高风险AD关联（评分>0.1）、有记录的AD关联（0<评分≤0.1）或无ad关联（评分=0）。我们的筛选结果在中高风险和中等风险ad基因中都得到了富集。这一点对于正向和负向irm调节因子都是成立的，因为open targets的基因评分并不考虑关联的方向（疾病风险与保护）（图2g）。

为了理解irm调节因子与阿尔茨海默病之间的关系方向，我们分析了我们的命中基因在ad患者来源的小胶质细胞中的表达差异。由于脑源小胶质细胞是一个异质群体，通常使用特定转录组簇或状态的富集或耗竭来进行研究，而不是全局上调或下调。我们首先确定了我们的irm调节因子与sun等人定义的人类患者来源小胶质细胞中的小胶质细胞簇的重叠（图2h）。正如预期的那样，我们的正向irm调节因子（敲低会降低ifit1表达）与mg11（一个干扰素信号通路基因模块）有重叠。我们还发现正向irm调节因子与mg6、mg7和mg12有重叠，这些模块分别与未折叠蛋白反应、糖酵解和增殖基因相关。我们的负向irm调节因子（敲低会驱动ifit1表达）与mg4簇有显著重叠，该簇参与脂质处理，以及mg10（一个神经炎症模块）。sun等人显示，mg4簇在ad患者的小胶质细胞中显著富集。这表明我们的负向irm调节因子在ad患者的大脑中富集。进一步的研究将有助于了解干扰素反应性小胶质细胞对这些疾病通路和细胞反应的准确影响。

在ips-microglia模型中，干扰素的典型调节作用是相关的

为了验证我们的筛选结果，我们生成了针对典型干扰素通路基因的独立crispri敲低系（敲低验证见补充图3）。我们的筛选结果表明，敲低i型干扰素受体ifnar2在ips-microglia中会消除对干扰素的反应（图2i）。有趣的是，我们发现缺乏ifnar2的小胶质细胞即使在基线水平上也表现出ifit1表达降低，这表明这种ips-microglia模型具有一定水平的持续ifnβ产生。这与之前的研究结果一致，这些研究通过单细胞rna测序分析强调了基线时存在irm23,36,42。泛素特异性肽酶18（usp18）竞争性地抑制jak1与ifnar2的结合，并阻止ifnar1和ifnar2的必需二聚化。敲低这种干扰素信号传导的负向调节因子在基线和干扰素刺激后都会增加ifit1的表达（图2j）。敲低usp18使ips-microglia对ifnβ的反应增强了两倍以上，表明usp18可能是治疗i型干扰素反应的一个有用靶点。我们之前已经发现敲低干扰素刺激基因15（isg15）也会增加ifit1的表达，尽管在isg15敲低的小胶质细胞中的效果比在usp18敲低的小胶质细胞中的效果小42。

酪氨酸激酶2（tyk2）与ifnar1/2结合，磷酸化信号转导和激活因子1和2（stat1和stat2）转录因子，这些因子对于干扰素反应基因的转录是必要的。正如预期的那样，在我们的ips-microglia系统中，ifnβ诱导的ifit1表达被tyk2抑制剂deucravacitinib阻断，尽管在没有ifnβ刺激的情况下没有检测到ifit1水平的差异（图2k）。

为了完成对典型干扰素通路调节的分析，我们最近还证明，在ips-microglia中敲低isg3复合体的任何成员（stat1、stat2和irf9）都会在转录组水平上降低干扰素反应42。

i型和ii型干扰素都被认为与阿尔茨海默病的进展有关，斑块相关的小胶质细胞显示出高水平的ifit1和mx111,16,43。通过crispri敲低典型的i型和ii型干扰素信号转导基因，我们发现mx1对ifnβ刺激有反应，并且这种反应可以通过敲低i型干扰素通路基因（ifnar2、stat1/2）来特异性阻断，但不会被ii型干扰素（ifngr1/2、stat3）阻断（图2l）。

ccr4-not转录复合体亚基10（cnot10）的敲低抑制irm

我们两个最显著的筛选命中结果中，敲低会降低ifit1的成员是ccr4-not转录复合体亚基10和11（cnot10、cnot11）。cnot10和cnot11都是负责mrna去腺苷化的ccr4-not转录复合体的亚基44,45,46（图3a）。虽然我们在ifit1筛选中发现reactome通路“mrna去腺苷化”显著富集（fdr=0.00187）（补充数据3），但需要注意的是，我们的筛选没有发现任何酶促去腺苷化亚基（cnot6、cnot6l、cnot7、cnot8）或复合体的骨架（cnot1）作为irm调节因子。我们使用单独的sgrna敲低系通过流式细胞术独立验证了这一结果。只有cnot10和cnot11的敲低降低了ifit1表达（图3b、c，补充图4），这表明该复合体的典型去腺苷化功能不能解释cnot10和cnot11敲低小胶质细胞中观察到的干扰素反应差异。我们通过多种状态标记和广泛的浓度范围确认了cnot10敲低抑制了irm（图3 c-g，补充图4）。我们的数据表明，cnot10敲低的小胶质细胞对干扰素的反应最大，其ec50右移。我们发现cnot11敲低在多个irm状态标记上的效果不太一致（补充图4），因此我们将分析重点放在cnot10上。

图3：敲低cnot10抑制irm。全尺寸图像

基因组范围筛选结果的火山图。基因评分（根据scrna在ifit1high和ifit1low群体中的计数比值的对数2标准化比值）与p值的负对数绘制。点代表针对该基因的五个单独scrna的平均基因评分。正向命中（基因敲低会降低ifit1表达）用红色表示，负向命中（基因敲低会抑制ifit1表达）用蓝色表示。非命中基因用灰色表示。由随机非targeting对照scrna生成的准基因用浅灰色表示。ccr4-not复合体的所有成员都进行了标记（显著基因用蓝色表示，非显著基因用黑色表示）。b ccr4-not家族中ifit1蛋白的中位荧光强度（mfi）与非targeting孔内对照进行了标准化（n=3-4个独立孔，每个重复实验超过10,000个细胞。条形图代表平均值±标准误差，t检验）。c cnot10敲低（洋红色）与非targeting对照（灰色）的干扰素反应剂量反应曲线。在ifnβ处理24小时后测量ifit1的中位荧光强度（mfi）。数据代表平均值±标准误差。n=3个独立孔，每个孔超过10,000个细胞。ec50通过prism的非线性拟合计算得出。d、e cnot10敲低（洋红色）与非targeting对照（灰色）sgrna中mx1和ifitm3蛋白的中位荧光强度（mfi）。在流式细胞术分析前24小时添加了指定浓度的ifnβ。n=3个独立孔，每个重复实验超过10,000个细胞。条形图代表平均值±标准误差，anova，tukey多重比较检验。f、g 通过免疫荧光成像显示的mx1和ifitm3的中位强度。代表性的图像显示了hoechst核染色（蓝色）和mx1或ifitm3（绿色）。比例尺=10 μm。mx1或ifitm3的每个细胞强度的量化基于核强度进行了标准化。n=3个孔，每个孔平均4张图像。 targets的基因评分并不考虑关联的方向（疾病风险与保护）（图2g）。 为了理解irm调节因子与阿尔茨海默病之间的关系方向，我们分析了我们的命中基因在ad患者来源的小胶质细胞中的表达差异。由于脑源小胶质细胞是一个异质群体，通常使用特定转录组簇或状态的富集或耗竭来进行研究，而不是全局上调或下调。我们首先确定了我们的irm调节因子与sun等人定义的人类患者来源小胶质细胞中的小胶质细胞簇的重叠（图2h）。正如预期的那样，我们的正向irm调节因子（敲低会降低ifit1表达）与mg11（一个干扰素信号通路基因模块）有重叠。我们还发现正向irm调节因子与mg6、mg7和mg12有重叠，这些模块分别与未折叠蛋白反应、糖酵解和增殖基因相关。我们的负向irm调节因子（敲低会驱动ifit1表达）与mg4簇有显著重叠，该簇参与脂质处理，以及mg10（一个神经炎症模块）。sun等人显示，mg4簇在ad患者的小胶质细胞中显著富集。这表明我们的负向irm调节因子在ad患者的大脑中富集。进一步的研究将有助于了解干扰素反应性小胶质细胞对这些疾病通路和细胞反应的准确影响。 在ips-microglia模型中，干扰素的典型调节作用是相关的 为了验证我们的筛选结果，我们生成了针对典型干扰素通路基因的独立crispri敲低系（敲低验证见补充图3）。我们的筛选结果表明，敲低i型干扰素受体ifnar2在ips-microglia中会消除对干扰素的反应（图2i）。有趣的是，我们发现缺乏ifnar2的小胶质细胞即使在基线水平上也表现出ifit1表达降低，这表明这种ips-microglia模型具有一定水平的持续ifnβ产生。这与之前的研究结果一致，这些研究通过单细胞rna测序分析强调了基线时存在irm23,36,42。泛素特异性肽酶18（usp18）竞争性地抑制jak1与ifnar2的结合，并阻止ifnar1和ifnar2的必需二聚化。敲低这种干扰素信号传导的负向调节因子在基线和干扰素刺激后都会增加ifit1的表达（图2j）。敲低usp18使ips-microglia对ifnβ的反应增强了两倍以上，表明usp18可能是治疗i型干扰素反应的一个有用靶点。我们之前已经发现敲低干扰素刺激基因15（isg15）也会增加ifit1的表达，尽管在isg15敲低的小胶质细胞中的效果比在usp18敲低的小胶质细胞中的效果小42。 酪氨酸激酶2（tyk2）与ifnar1 2结合，磷酸化信号转导和激活因子1和2（stat1和stat2）转录因子，这些因子对于干扰素反应基因的转录是必要的。正如预期的那样，在我们的ips-microglia系统中，ifnβ诱导的ifit1表达被tyk2抑制剂deucravacitinib阻断，尽管在没有ifnβ刺激的情况下没有检测到ifit1水平的差异（图2k）。 为了完成对典型干扰素通路调节的分析，我们最近还证明，在ips-microglia中敲低isg3复合体的任何成员（stat1、stat2和irf9）都会在转录组水平上降低干扰素反应42。 i型和ii型干扰素都被认为与阿尔茨海默病的进展有关，斑块相关的小胶质细胞显示出高水平的ifit1和mx111,16,43。通过crispri敲低典型的i型和ii型干扰素信号转导基因，我们发现mx1对ifnβ刺激有反应，并且这种反应可以通过敲低i型干扰素通路基因（ifnar2、stat1 2）来特异性阻断，但不会被ii型干扰素（ifngr1 2、stat3）阻断（图2l）。 ccr4-not转录复合体亚基10（cnot10）的敲低抑制irm 我们两个最显著的筛选命中结果中，敲低会降低ifit1的成员是ccr4-not转录复合体亚基10和11（cnot10、cnot11）。cnot10和cnot11都是负责mrna去腺苷化的ccr4-not转录复合体的亚基44,45,46（图3a）。虽然我们在ifit1筛选中发现reactome通路“mrna去腺苷化”显著富集（fdr=0.00187）（补充数据3），但需要注意的是，我们的筛选没有发现任何酶促去腺苷化亚基（CNOT6、CNOT6L、CNOT7、CNOT8）或复合体的骨架（CNOT1）作为IRM调节因子。我们使用单独的sgRNA敲低系通过流式细胞术独立验证了这一结果。只有CNOT10和CNOT11的敲低降低了IFIT1表达（图3B、C，补充图4），这表明该复合体的典型去腺苷化功能不能解释CNOT10和CNOT11敲低小胶质细胞中观察到的干扰素反应差异。我们通过多种状态标记和广泛的浓度范围确认了CNOT10敲低抑制了IRM（图3 c-g，补充图4）。我们的数据表明，cnot10敲低的小胶质细胞对干扰素的反应最大，其ec50右移。我们发现cnot11敲低在多个irm状态标记上的效果不太一致（补充图4），因此我们将分析重点放在cnot10上。 图3：敲低cnot10抑制irm。全尺寸图像 基因组范围筛选结果的火山图。基因评分（根据scrna在ifit1high和ifit1low群体中的计数比值的对数2标准化比值）与p值的负对数绘制。点代表针对该基因的五个单独scrna的平均基因评分。正向命中（基因敲低会降低ifit1表达）用红色表示，负向命中（基因敲低会抑制ifit1表达）用蓝色表示。非命中基因用灰色表示。由随机非targeting对照scrna生成的准基因用浅灰色表示。ccr4-not复合体的所有成员都进行了标记（显著基因用蓝色表示，非显著基因用黑色表示）。b ccr4-not家族中ifit1蛋白的中位荧光强度（mfi）与非targeting孔内对照进行了标准化（n=3-4个独立孔，每个重复实验超过10,000个细胞。条形图代表平均值±标准误差，T检验）。C cnot10敲低（洋红色）与非targeting对照（灰色）的干扰素反应剂量反应曲线。在ifnβ处理24小时后测量ifit1的中位荧光强度（mfi）。数据代表平均值±标准误差。n=3个独立孔，每个孔超过10,000个细胞。EC50通过Prism的非线性拟合计算得出。D、E cnot10敲低（洋红色）与非targeting对照（灰色）sgrna中mx1和ifitm3蛋白的中位荧光强度（mfi）。在流式细胞术分析前24小时添加了指定浓度的ifnβ。n=3个独立孔，每个重复实验超过10,000个细胞。条形图代表平均值±标准误差，ANOVA，Tukey多重比较检验。F、G 通过免疫荧光成像显示的mx1和ifitm3的中位强度。代表性的图像显示了hoechst核染色（蓝色）和mx1或ifitm3（绿色）。比例尺=10 μm。mx1或ifitm3的每个细胞强度的量化基于核强度进行了标准化。n=>
为了理解irm调节因子与阿尔茨海默病之间的关系方向，我们分析了我们的命中基因在ad患者来源的小胶质细胞中的表达差异。由于脑源小胶质细胞是一个异质群体，通常使用特定转录组簇或状态的富集或耗竭来进行研究，而不是全局上调或下调。我们首先确定了我们的irm调节因子与sun等人定义的人类患者来源小胶质细胞中的小胶质细胞簇的重叠（图2h）。正如预期的那样，我们的正向irm调节因子（敲低会降低ifit1表达）与mg11（一个干扰素信号通路基因模块）有重叠。我们还发现正向irm调节因子与mg6、mg7和mg12有重叠，这些模块分别与未折叠蛋白反应、糖酵解和增殖基因相关。我们的负向irm调节因子（敲低会驱动ifit1表达）与mg4簇有显著重叠，该簇参与脂质处理，以及mg10（一个神经炎症模块）。sun等人显示，mg4簇在ad患者的小胶质细胞中显著富集。这表明我们的负向irm调节因子在ad患者的大脑中富集。进一步的研究将有助于了解干扰素反应性小胶质细胞对这些疾病通路和细胞反应的准确影响。

在ips-microglia模型中，干扰素的典型调节作用是相关的

为了验证我们的筛选结果，我们生成了针对典型干扰素通路基因的独立crispri敲低系（敲低验证见补充图3）。我们的筛选结果表明，敲低i型干扰素受体ifnar2在ips-microglia中会消除对干扰素的反应（图2i）。有趣的是，我们发现缺乏ifnar2的小胶质细胞即使在基线水平上也表现出ifit1表达降低，这表明这种ips-microglia模型具有一定水平的持续ifnβ产生。这与之前的研究结果一致，这些研究通过单细胞rna测序分析强调了基线时存在irm23,36,42。泛素特异性肽酶18（usp18）竞争性地抑制jak1与ifnar2的结合，并阻止ifnar1和ifnar2的必需二聚化。敲低这种干扰素信号传导的负向调节因子在基线和干扰素刺激后都会增加ifit1的表达（图2j）。敲低usp18使ips-microglia对ifnβ的反应增强了两倍以上，表明usp18可能是治疗i型干扰素反应的一个有用靶点。我们之前已经发现敲低干扰素刺激基因15（isg15）也会增加ifit1的表达，尽管在isg15敲低的小胶质细胞中的效果比在usp18敲低的小胶质细胞中的效果小42。

酪氨酸激酶2（tyk2）与ifnar1/2结合，磷酸化信号转导和激活因子1和2（stat1和stat2）转录因子，这些因子对于干扰素反应基因的转录是必要的。正如预期的那样，在我们的ips-microglia系统中，ifnβ诱导的ifit1表达被tyk2抑制剂deucravacitinib阻断，尽管在没有ifnβ刺激的情况下没有检测到ifit1水平的差异（图2k）。

为了完成对典型干扰素通路调节的分析，我们最近还证明，在ips-microglia中敲低isg3复合体的任何成员（stat1、stat2和irf9）都会在转录组水平上降低干扰素反应42。

i型和ii型干扰素都被认为与阿尔茨海默病的进展有关，斑块相关的小胶质细胞显示出高水平的ifit1和mx111,16,43。通过crispri敲低典型的i型和ii型干扰素信号转导基因，我们发现mx1对ifnβ刺激有反应，并且这种反应可以通过敲低i型干扰素通路基因（ifnar2、stat1/2）来特异性阻断，但不会被ii型干扰素（ifngr1/2、stat3）阻断（图2l）。

ccr4-not转录复合体亚基10（cnot10）的敲低抑制irm

我们两个最显著的筛选命中结果中，敲低会降低ifit1的成员是ccr4-not转录复合体亚基10和11（cnot10、cnot11）。cnot10和cnot11都是负责mrna去腺苷化的ccr4-not转录复合体的亚基44,45,46（图3a）。虽然我们在ifit1筛选中发现reactome通路“mrna去腺苷化”显著富集（fdr=0.00187）（补充数据3），但需要注意的是，我们的筛选没有发现任何酶促去腺苷化亚基（cnot6、cnot6l、cnot7、cnot8）或复合体的骨架（cnot1）作为irm调节因子。我们使用单独的sgrna敲低系通过流式细胞术独立验证了这一结果。只有cnot10和cnot11的敲低降低了ifit1表达（图3b、c，补充图4），这表明该复合体的典型去腺苷化功能不能解释cnot10和cnot11敲低小胶质细胞中观察到的干扰素反应差异。我们通过多种状态标记和广泛的浓度范围确认了cnot10敲低抑制了irm（图3 c-g，补充图4）。我们的数据表明，cnot10敲低的小胶质细胞对干扰素的反应最大，其ec50右移。我们发现cnot11敲低在多个irm状态标记上的效果不太一致（补充图4），因此我们将分析重点放在cnot10上。

图3：敲低cnot10抑制irm。全尺寸图像

基因组范围筛选结果的火山图。基因评分（根据scrna在ifit1high和ifit1low群体中的计数比值的对数2标准化比值）与p值的负对数绘制。点代表针对该基因的五个单独scrna的平均基因评分。正向命中（基因敲低会降低ifit1表达）用红色表示，负向命中（基因敲低会抑制ifit1表达）用蓝色表示。非命中基因用灰色表示。由随机非targeting对照scrna生成的准基因用浅灰色表示。ccr4-not复合体的所有成员都进行了标记（显著基因用蓝色表示，非显著基因用黑色表示）。b ccr4-not家族中ifit1蛋白的中位荧光强度（mfi）与非targeting孔内对照进行了标准化（n=3-4个独立孔，每个重复实验超过10,000个细胞。条形图代表平均值±标准误差，t检验）。c cnot10敲低（洋红色）与非targeting对照（灰色）的干扰素反应剂量反应曲线。在ifnβ处理24小时后测量ifit1的中位荧光强度（mfi）。数据代表平均值±标准误差。n=3个独立孔，每个孔超过10,000个细胞。ec50通过prism的非线性拟合计算得出。d、e cnot10敲低（洋红色）与非targeting对照（灰色）sgrna中mx1和ifitm3蛋白的中位荧光强度（mfi）。在流式细胞术分析前24小时添加了指定浓度的ifnβ。n=3个独立孔，每个重复实验超过10,000个细胞。条形图代表平均值±标准误差，anova，tukey多重比较检验。f、g 通过免疫荧光成像显示的mx1和ifitm3的中位强度。代表性的图像显示了hoechst核染色（蓝色）和mx1或ifitm3（绿色）。比例尺=10 μm。mx1或ifitm3的每个细胞强度的量化基于核强度进行了标准化。n=3个孔，每个孔平均4张图像。>单因素方差分析（One-way ANOVA）的P值。(H) CNOT10敲低（紫色）与非靶向对照（灰色）细胞中CD9表面蛋白的中位荧光强度（MFI）水平。在流式细胞术分析前24小时添加了250 nM的油酸。每个重复实验有3个独立孔，每个孔中的细胞数超过10,000个。条形图表示平均值±标准误差，采用ANOVA和Tukey多重比较检验。(I) CNOT10敲低细胞与非靶向对照细胞中差异表达基因的火山图。在CNOT10敲低组中表达增加或减少的基因分别用红色或蓝色标记（FDR ≤ 0.05）。与干扰素、小胶质细胞稳态标志物或核酸感应相关的基因被突出显示。(J) 来自CNOT10敲低或非靶向对照sgRNA的小胶质细胞的单细胞RNA测序（PIP-seq）中的独特分子标识符（UMI）数量，每种样本共2个。Mann-Whitney U检验P值 = 9.6×10^-30。(K) 通过流式细胞术测量的iPS-Microglia中CNOT10敲低组或非靶向对照sgRNA组的双链RNA（dsRNA）的中位荧光强度（MFI）。对于标示的条形图，在固定之前添加了10 pM的IFNβ持续24小时，或在固定后添加了1 μg/mL的RNase A持续30分钟。条形图表示平均值±标准误差，采用配对t检验。对于非靶向对照和CNOT10敲低组的比较，每个独立孔有3个孔，每个孔中的细胞数超过10,000个。对于RNase对照，每个孔有1个孔，每个孔中的细胞数超过10,000个。(L) 通过流式细胞术测量的iPS-Microglia中CNOT10敲低组（紫色）或非靶向对照（灰色）sgRNA组的LINE1 DNA的中位荧光强度（MFI）。对于标示的条形图，在固定之前添加了10 pM的IFNβ持续24小时。每个独立孔有3个孔，每个孔中的细胞数超过10,000个。条形图表示平均值±标准误差，采用配对t检验。

由于CNOT10是一个参与mRNA去腺苷酸化的复合体，因此其敲低可能会全局性地改变mRNA的稳定性，并影响小胶质细胞向多种激活状态的转化。如果mRNA普遍不稳定，我们预计CNOT10敲低的小胶质细胞将无法激活到任何激活状态。因此，我们通过染色检测其他小胶质细胞激活状态的标志物来测试我们识别出的IRM（干扰素反应）表型的特异性，包括与疾病相关的（CD9、TREM2）、分泌趋化因子的（CCL2、CCL13）、稳态相关的（P2RY12）和抗原呈递的（HLA-DMB、CD74）状态。我们发现，在CNOT10或CNOT11敲低的小胶质细胞中，这些状态标志物都没有受到抑制（见补充图5）。当使用油酸诱导向疾病相关状态转化时，非靶向对照sgRNA和CNOT10敲低的小胶质细胞都同样程度地激活了CD9的表达（见图3H）。

由于规模限制，我们最初的全基因组筛选只在一个iPSC系的小胶质细胞上进行，并从小胶质细胞分化的早期开始使用CRISPRi进行敲低，以产生最明显的敲低效应，并最大化发现IRM调节因子。为了测试我们的CNOT10敲低表型是否能够在来自独立iPSC系的小胶质细胞中稳健地再现，我们使用了一种正交的敲低方法（RNAi），并在小胶质细胞成熟后敲低目标基因，进行了额外的实验。通过这些正交方法，我们确认CNOT10敲低的小胶质细胞中的ISGs（干扰素反应相关基因）IFIT1、MX1和IFITM3的水平低于转导了对照siRNA的细胞（见补充图6A-D）。我们还确认了IRM状态的特异性，因为在CNOT10 RNAi敲低后，其他激活状态的标志物没有减少（见补充图6E-H）。

为了更详细地研究CNOT10敲低对mRNA、小胶质细胞激活和干扰素反应的影响，我们在IFNβ刺激24小时后对CNOT10敲低组或非靶向对照组的小胶质细胞进行了单细胞RNA测序（见图3I，补充数据7）。由于CCR4-NOT参与了mRNA的稳定性，我们比较了CNOT10敲低组与非靶向对照细胞中每个细胞的独特分子标识符（UMI）数量。有趣的是，我们确实发现CNOT10敲低组的小胶质细胞中的UMI数量略有但显著减少（见图3J）。这可能表明CNOT10敲低的小胶质细胞中通过Particle-templated Instant Partitions测序（PIP-seq）捕获的多聚腺苷酸化mRNA水平较低。然而，这种效应很小，并不表明mRNA发生了大规模的破坏。考虑到其他生物（如酵母）没有CNOT10的直系同源物但仍能维持CCR4-NOT的功能，mRNA去腺苷酸化在CNOT10缺失的情况下仍然能够继续进行。

CNOT10敲低的小胶质细胞与非靶向对照细胞之间的mRNA差异表达显示，正向和负向差异表达的基因数量大致相等（CNOT10敲低组中有403个基因表达增加，506个基因表达减少），这支持了我们的假设，即IRM的抑制并非仅仅是mRNA普遍减少的副产品。结合我们的蛋白质水平发现，多个受干扰素刺激的基因在CNOT10敲低的小胶质细胞中的表达水平降低，特别是IFIT1、IFIT3、IFI6、IFI30、IFIT5和IFITM1（见图3I，补充数据7）。S100B的表达也在CNOT10敲低的小胶质细胞中丢失，而S100B是一种最近被证明对IFNβ与IFNAR1的结合至关重要的分泌因子。值得注意的是，在CNOT10敲低的小胶质细胞中，几个参与核酸感应的基因的表达发生了变化，核酸感应是IRM的重要驱动因素。然而，编码核酸感应蛋白环状GMP-AMP合成酶（CGAS）和干扰素诱导的带有Helicase C结构域1（IFIH1）的转录本水平却增加了。然而，在CNOT10敲低的小胶质细胞中，上游的dsRNA结合蛋白2’，5’寡腺苷酸化酶（OAS3）的表达减少了。尽管CNOT10敲低的小胶质细胞的干扰素反应较低，但我们并未发现dsRNA增加的证据（见图3K）。此外，我们也没有发现LINE1 DNA增加的证据，而LINE1 DNA是另一种通过核酸感应途径诱导干扰素反应的因子（见图3L）。

进一步支持我们对CNOT10敲低的蛋白质水平分析，我们的RNA测序数据显示CD9、TREM2或CCL13等激活状态标志物的mRNA表达没有差异。有趣的是，尽管CNOT10敲低的小胶质细胞似乎没有强烈激活，但我们发现它们的稳态标志物CX3CR1、P2RY12和P2RY13的水平降低了（见图3I）。为了进一步确保mRNA水平下降的稳态标志物并不表示小胶质细胞身份的丧失，我们用CD45、CD11b、PU.1和IBA1对CNOT10敲低的小胶质细胞进行了染色，发现这些标志物的水平与非靶向对照细胞相比没有下降（见补充图7）。

重要的是，在我们的CNOT10敲低细胞中，CNOT10的mRNA表达水平降低，而所有其他CCR4-NOT复合体亚基的表达保持不变（见补充数据7）。由于CCR4-NOT复合体可以在没有CNOT10的情况下发挥作用，因此我们的敲低细胞可能仍然具有去腺苷酸化的能力。然而，CNOT10敲低的小胶质细胞表现出可能影响全局翻译的基因表达变化。一方面，在CNOT10敲低的小胶质细胞中，编码小核糖体蛋白和大核糖体蛋白亚基的基因表达增加。另一方面，许多翻译起始因子的表达在CNOT10敲低的小胶质细胞中增加。参与核糖体RNA转录的TATA-box结合蛋白相关因子RNA聚合酶I亚基B（TAF1B）在CNOT10敲低细胞中的表达也增加了。总体而言，这些结果表明可能存在翻译变化，尽管尚不清楚这会如何影响特定的小胶质细胞激活状态（IRM）而非其他状态（如疾病相关、稳态、分泌趋化因子、抗原呈递）。

在这项研究中，我们进行了一项全基因组的CRISPR干扰筛选，以检测I型干扰素标志物IFIT1的表达。初步调查了干扰素刺激基因（ISGs）在转录组水平上的浓度依赖性反应，发现10 pM与100 pM IFNβ下的ISG诱导水平有高度相关性，表明在这两个浓度下没有两种不同的反应模式。然而，在蛋白质水平上，包括CXCL10和CD38在内的一部分ISGs在50 pM IFNβ下显示出中位反应，而大多数ISGs在较低浓度的IFNβ（约5 pM）下达到峰值。在未来的工作中，了解低IFN反应模式和高IFN反应模式之间的功能差异可能是有用的，以确定是否存在两类不同的干扰素反应小胶质细胞，或者更高浓度是否只是加剧了相同的反应。

这里基于IFIT1的筛选依赖于急性干扰素处理，这可能更反映了病毒感染或神经退行性疾病的早期阶段。在tau病理学中，已经显示I型干扰素反应在疾病早期特别显著。我们的全基因组IRM筛选并未测试小胶质细胞对慢性神经炎症条件（如长期COVID或多发性硬化症）的反应。未来的研究需要在慢性高干扰素环境中测试我们识别的激活因子/抑制剂。这可以在体外通过几周的重复干扰素刺激来模拟，或在体内通过将神经炎症或神经退行性疾病模型与小胶质细胞特异性基因敲低相结合来研究。

我们在全基因组筛选中识别出的一组调节因子支持了IRM通过典型的干扰素信号转导途径进行调控的假设。这一发现表明，用于对抗外周干扰素和病毒反应的工具可以应用于中枢神经系统。例如，我们注意到STAT1、STAT2、IFNAR2、TYK2和USP18的敲低可以按预期方式调节小胶质细胞中的IFIT1表达。出乎意料的是，我们的初步筛选没有将IFNAR1（IFNβ的共受体）作为IFIT1的调节因子。经过进一步分析，我们确定我们的IFNAR1靶向sgRNAs并未在mRNA水平上干扰IFNAR1的功能（见补充图3C）。最后，我们展示了Deucravacitinib（FDA批准的TYK2抑制剂）可以阻断iPS-Microglia中的干扰素反应。未来，我们可以使用完整的IRM调节因子目录来推荐其他现有的FDA批准的治疗药物，这些药物可能能够干扰小胶质细胞的干扰素反应。

干扰素反应途径存在高度的冗余性。例如，IFNα家族中有13种蛋白质，蛋白质抑制剂活性STAT（PIAS）家族的多个成员，以及多种编码泛素的基因和E3连接酶能够负调控干扰素信号传导。虽然我们的筛选确实显示了Reactome途径“Regulation of IFNA IFNB Signaling”中的基因集显著富集（FDR = 7.11E-5），但在这些基因中只有9个在我们的筛选中是显著调节因子。因此，这9个基因（IFNAR2、TYK2、JAK1、STAT1、STAT2、USP18、PTPN1、PTPN6和SOCS3）必须在小胶质细胞中具有非冗余的功能，因为我们能够通过敲低每个单独的节点来调节IRM。相比之下，该途径中的其余48个基因可能由于上述的冗余性而得到缓冲。这一区分突显了我们筛选方法的一个关键特点，即它优先发现那些不具冗余性的调节节点，这些节点更利于治疗开发。

有趣的是，对于其中一个典型的调节因子——蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTPN1），我们发现其调控IRM的方向与预期相反。PTPN1已知能够去磷酸化JAK1和TYK2，从而作为干扰素信号的负调节因子。然而，也有报道指出PTPN1敲除的巨噬细胞分泌的I型干扰素水平较低，这表明PTPN1可能正调控第二波干扰素信号。这一功能与其磷酸酶活性无关，而是依赖于其在内质网中的定位。我们的筛选发现PTPN1是小胶质细胞中IFIT1表达的正调节因子（敲低PTPN1会降低IFIT1的表达），从而支持了这一非典型功能。PTPN1作为II型糖尿病、肥胖症和癌症的治疗靶点，因其涉及胰岛素敏感性、瘦素抵抗和炎症的作用而受到关注。我们的工作表明，PTPN1抑制剂也可能适用于大脑，以减少干扰素反应的小胶质细胞。Cen等人最近使用小分子DPM-1003在阿尔茨海默病的小鼠模型中测试了这一假设，发现它对斑块负荷和记忆有有益效果，并证实了我们在小胶质细胞中阻断PTPN1可以提高ISGs的水平。

除了识别典型的干扰素信号基因外，我们的筛选还发现了许多新的IRM调节因子。有趣的是，我们发现许多与阿尔茨海默病（AD）风险相关的基因位点中的基因改变了IFIT1的表达水平。在1077个AD风险位点基因中，有128个在我们的全基因组筛选中被选中。在这些基因中，有101个通过CRISPRi敲低后能够驱动干扰素反应。然而，这对其它阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）病理学的影响仍不清楚，因为许多与AD风险相关的基因位点尚未被映射到特定的致病基因上，即使对于那些已经确定了致病基因的位点，SNP的功能影响也尚未完全理解。特别值得关注的是，我们发现敲低APOE和INPP5D可以增加IFIT1的水平。先前的研究已经表明，携带APOE ε4变异体的人血清和血浆中的IFNβ水平较高。同样，APOE ε4本身被鉴定为白细胞免疫球蛋白样受体B3（LILRB3）的配体，它可以触发下游的干扰素反应，而APOE ε2则不会产生这种反应。类似地，研究还发现INPP5D可以通过与IRF3结合来抑制干扰素。这种机制是否是INPP5D对神经退行性疾病产生影响的基础仍不清楚。我们还发现CD33和PTPN6能够抑制IRM（interferon response modulators）。CD33是一种结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素（siglec），它通过其免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）来调节激活。CD33可以通过与两种关键的磷酸酶PTPN6和PTPN11相互作用来调控。在这两种磷酸酶中，只有PTPN6被证实与AD风险相关。我们发现只有CD33和PTPN6能够抑制IRM，而不是PTPN11，这与它们与AD风险的关联是一致的。这些证据支持了这样一个假设：CD33和PTPN6的突变可能通过抑制IRM状态来影响AD风险。最近的研究还表明，PTPN6可以通过调节DAM（DNA activators and modulators）状态来影响AD的病理过程，尽管大量的RNA测序数据显示在PTPN6敲除后ISGs（induced signaling genes）的水平有所增加。未来的研究将需要进一步解析这两种与疾病相关的激活状态对大脑健康的影响。

我们发现的两个重要的新IRM调节因子是CCR4-NOT转录复合体的亚基10和11（CNOT10、CNOT11）。CNOT10和CNOT11在2013年被鉴定为真核生物CCR4-NOT复合体的新亚基。这些亚基比CCR4-NOT复合体的其他亚基进化得更晚，在酵母中没有任何同源物。虽然CNOT10和CNOT11确实参与了CCR4-NOT的去腺苷化功能，尤其是帮助核糖体结合，但它们也被发现可以与生殖基因结合蛋白2（GGNBP2）相互作用。这种相互作用被认为可以通过将未被腺苷脱氨酶RNA特异性酶（ADAR）编辑的天然双链RNA（dsRNA）重新定位到细胞质外，从而影响干扰素反应。Heraud-Farlow及其同事的研究表明，在髓系细胞中敲低CNOT10或CNOT11会限制干扰素反应，这与我们观察到的效果一致。然而，Heraud-Farlow的研究仅在ADAR编辑突变体中发现了这种相互作用，而我们的iPS-小胶质细胞（iPS-Microglia）仍然具有ADAR活性。此外，我们的CNOT10敲除的小胶质细胞中dsRNA和LINE1 DNA水平的变化幅度较小。尽管如此，这可能表明在这个iPS-小胶质细胞模型中，持续的干扰素信号传导部分是由核酸识别驱动的。相反，Gordon等人发现CNOT10敲除会增强干扰素反应，从而提高抗病毒活性。这项研究是在HeLa细胞和原代CD4+ T细胞中进行的，这可能解释了研究结果的差异。我们和Heraud-Farlow发现的结果可能是特定于髓系谱系的，不过需要进一步的研究来验证这一假设。

由于我们进行了全基因组范围的筛选，因此我们只能使用来自同一患者背景的小胶质细胞，并且只使用了一个IRM状态的标记物。在研究CNOT10和CNOT11时，我们还使用了其他标记物和不同的患者背景来验证IRM状态。在对这些新的IFIT1调节因子的影响做出结论之前，应该对它们进行更多的研究。全基因组筛选的另一个限制是在小胶质细胞分化过程中进行了基因敲低。有可能我们发现的一些因子是通过干扰小胶质细胞的分化过程来影响IFIT1表达的，尽管我们没有直接的证据支持这一点。我们之前已经证明，在细胞分化后诱导基因敲低会降低CRISPR抑制的效果，这可能是由于染色质状态的变化。然而，由于这种设计，我们不能排除某些IFIT1调节因子仅仅改变了小胶质细胞分化的可能性。对于CNOT10和CNOT11，我们确认了它们确实能够抑制IRM表达。

总结来说，我们的研究结果定义了一组典型的和非典型的干扰素响应性小胶质细胞激活状态的调节因子，并指出了干扰素响应途径中的关键节点，这些节点可以用于在不同发育和疾病背景下调节小胶质细胞的功能。

### 方法
#### iPSC维护
人类iPSC（WTC11或KOLF2.1 J背景，含有多西环素可诱导的转录因子：CEPBA、CEPBB、IRF5、IRF8、MAFB、PU.1）在StemFlex（Gibco, A33493-01）培养基中培养，培养基涂抹在Coating Matrigel（Corning, 356231）板上。每天更换培养基，并每周使用ReLeSR（100-0483）进行细胞传代。加州大学旧金山分校的人类iPSC研究经过了人类配子、胚胎和干细胞研究委员会的批准。

#### iPS-小胶质细胞的分化
iPS-小胶质细胞的分化方法如先前所述，使用了优化过的培养基组成以增加P2RY12、TREM2和CD33的表达。含有六种多西环素可诱导转录因子的iPSC用蛋白酶accutase（Thermo Fisher Scientific, A11105-01）在37°C下处理7分钟，使其成为单细胞悬浮液，然后传代到双涂层Matrigel（Corning, 356231）和PDL板（Corning, 356470）上。在含有2 μg/mL多西环素（Clontech, 631311）和10 μM Y-27632（Tocris 1254）的Essential 8（Gibco, A1517001）干细胞维持培养基中培养48小时后，将细胞转换为小胶质细胞分化培养基：BrainPhys（StemCell Technologies, 05790），以及0.5x N2补充剂（Gibco, 17502048）、0.5x B27（Gibco, 17504044）、10 ng/mL NT-3（Peprotech, 450-03）、10 ng/mL BDNF（Peprotech, 450-02）、1 μg/mL小鼠层粘连蛋白（Thermo Fisher Scientific, 23017-015），并添加2 μg/mL多西环素、100 ng/mL IL-34（Peprotech 200-34）和10 ng/mL GM-CSF（Peprotech 300-03）。在第4天、第8天和第12天，培养基更换为添加了2 μg/mL多西环素、100 ng/mL IL-34、10 ng/mL GM-CSF、50 ng/mL M-CSF（Peprotech 300-25）和50 ng/mL TGFB（Peprotech 100-21C）的小胶质细胞分化培养基。在使用CRISPri进行实验时，每隔一天添加50 nM TMP（MP Biomedical, 195527）以维持强烈的敲低效果。

#### 流式细胞术
分化13天后，iPS-小胶质细胞用TrypLE（Gibco, 12604021）在37°C下处理10分钟以释放细胞。使用等体积的Advanced DMEM F12（Gibco, 12634028）淬灭酶活性，然后以300 xG的离心力离心5分钟。对于具有内源性非靶向控制的样本，BFP表达被替换为mApple表达。对于细胞外标记物（CD38、CD9、P2RY12），细胞在4°C下与抗体孵育30分钟。对于细胞内染色（IFIT1、IFITM3、IFI6、CXCL10、MX1、dsRNA），细胞在室温下用eBioscience Intracellular Fixation and Permeabilization Buffer Set（Invitrogen, 888-8824-00）固定20分钟。洗涤后，加入抗体在4°C下的渗透缓冲液中孵育30分钟。

#### 细胞免疫化学
洗涤后，用4%的戊二醛固定细胞7分钟，然后在DPBS 0.01% Triton X-100和5%山羊血清中封闭1小时。抗体在4°C下过夜孵育（anti-MX1, Cell Signaling, 37849, 1:500；anti-IFITM3, Proteintech, 11714-1-AP, 1:100；anti-IFI6, Invitrogen, PA5-76860, 1:100；anti-CXCL10, Biolegend, 519504, 1:50；anti-MX1, CellSignaling, 37849S, 1:200；anti-dsRNA, Absolute Antibody, Ab00458-23.0, 1:250；anti-CD74, Biolegend 326808, 1:50；anti-CCL2, Biolegend, 505910, 1:50；anti-CCL13, R&D Systems, IC327G, 1:50；anti-TREM2, R&D Systems, MAB18281, 1:100）。对于dsRNA和anti-MX1、anti-TREM2，先用渗透缓冲液洗涤细胞，然后加入Goat anti-Rabbit 488（Invitrogen, A-11008, 1:500）或Goat anti-Mouse 555（Invitrogen, A-11029, 1:50）处理30分钟。

#### 样本分析
样本使用BD LSR Fortessa X14和BD FACSDiva软件进行分析。通过FlowJo分析软件计算平均荧光强度，筛选出活的单个细胞后进行数据统计。每个实验从3次独立的分化过程中获取数据，每个分组有3个重复孔（n > 10,000个细胞）。对于刺激条件，除非另有说明，否则在释放细胞前24小时添加10 pM的IFNβ（Gibco, AF-300-02B）。为了分析分泌蛋白（CXCL10），在释放细胞前6小时添加GolgiPlug（BD Biosciences, 555029, 1:1000）。为了分析dsRNA，在固定和渗透后但在抗体染色前，细胞用1 μg/mL的RNase A（EN0531）在低盐条件下处理30分钟。

#### 免疫细胞化学
洗涤后，用4%的戊二醛固定细胞7分钟，然后在DPBS 0.01% Triton X-100和5%山羊血清中封闭1小时。抗体在4°C下过夜孵育（anti-MX1, Cell Signaling, 37849, 1:500；anti-IFITM3, Proteintech, 11714-1-AP, 1:500）。细胞用DBPS洗涤3次后，加入1:1000稀释的Hoechst 1:10000和二次抗体。30分钟后，再用DPBS洗涤细胞并储存于0.5%的NaN3中。

#### 慢病毒生成
慢病毒的生成方法如先前所述。简要来说，HEK-293T细胞接种24小时后达到80-95%的融合度。对于2 mL的培养基，混合1 μg的转移质粒和第三代包装混合物以及100 μL的Optimem（Gibco, 31985088）和12 μL的TransIT-Lenti转染试剂（Mirusbio, MIR 6604）。转染混合物在室温下孵育10分钟，然后加入HEK-293T细胞。48小时后，收集培养基并通过0.45 μm的PVDF过滤器过滤。按照制造商的协议使用Lentivirus Precipitation溶液（Alstem, VC125）。

#### iPSC感染
iPSC在传代时以单细胞形式感染病毒，并允许表达48小时，然后用1 μg/mL的嘌呤霉素选择两个传代，直到获得>95%的BFP阳性细胞群。对于CRISPRi筛选文库，以0.3的MOI（millional of infection）进行转染，以避免同一细胞内同时转染两个sgRNA。

#### 全基因组CRISPri筛选
对于全基因组筛选，如先前所述，将七个子文库（CRISPRi_v2，“top5” sgRNAs）克隆到iPSC中。每个子文库以0.3的MOI进行转染，每个引导序列在至少1000个细胞中表达。对于所有使用CRISPri文库的iPSC的维持，包括常规传代、冷冻和分化，细胞的覆盖度至少为1000倍（每个sgRNA超过1000个细胞）。

#### IFIT1筛选
每个iPSC子文库接种到八个15厘米的培养板上，每个培养板接种1000万个iPSC，并按照上述方法进行分化，从第0天开始使用TMP诱导CRISPri活性。在第8天，iPS-小胶质细胞用10 pM的IFNβ处理24小时。第9天，用TrypLE在37°C下处理10分钟以释放细胞，然后用TBS + 3% BSA + 0.5 μM EDTA淬灭。释放后，细胞用Zombie Red Fixable Viability kit（Biolegend, 423110, 1:200）在4°C下染色10分钟。由于基于甲醛的固定会干扰后续的基因组DNA分离和PCR，因此按照先前描述的方法使用锌固定缓冲液（0.1 M Tris-HCl, pH 6.5, 0.5% ZnCl2, 0.5% Zn Acetate, 0.05% CaCl2）在4°C下固定细胞过夜。固定后，细胞用TBS + 3% BSA + 0.5 μM EDTA在4°C下染色30分钟。抗体用TBS + 3% BSA + 0.5 μM EDTA洗去，并通过20 μm的过滤器过滤以去除细胞团块。对于每个文库，使用BD FACSAria Fusion流式细胞仪对≥80 M的iPS-小胶质细胞进行分选，以确保高和低IFIT1表达群体中引导序列的覆盖度均超过1000倍。根据活的单个细胞进行分选，并将细胞分为IFIT1表达最高的30%和最低的30%两个组。分选后，使用NucleoSpin Blood L kit（Macherey-Nagel, 740954.20）分离基因组DNA。按照先前描述的方法分离和扩增sgRNA卡盒，并在Illumina HiSeq-4000上进行测序。

#### CRISPri筛选分析
CRISPri筛选文库的分析方法如先前所述。原始测序结果使用‘sgcount’进行分析，‘crispr_screen’用于基于‘drop first’加权策略进行差异表达分析，并使用Benjamini-Hochberg多重假设校正。根据每个文库内的非靶向引导序列独立计算显著的引导序列富集度。为了控制每个基因被5个独立单引导序列靶向的变异，将非靶向对照引导序列分组为“混杂基因”，这些基因是从所有非靶向引导序列中随机抽取的。我们设置了z分数截止值5来去除可能具有脱靶效应的非靶向对照。为了在同一图中显示所有七个子文库，将IFIT1高表达组与IFIT1低表达组的引导序列频率的对数2倍变化（log2(fold change）标准化为该子文库非靶向引导序列的标准差。简而言之，Gemini的任务是通过将基因分为三类来确定每个基因 Hit 与干扰素信号通路之间的关联强度。
**类别 1：** 直接影响 I 型干扰素下游信号转导的经典干扰素信号通路基因。这些基因通常包括 JAK-STAT 通路中的关键成分，如 JAK 测激酶、STAT 转录因子、IRFs 以及其他公认的 I 型干扰素信号通路组件（例如 TYK2、ISGF3 等）。
**类别 2：** 有文献支持或有限证据表明可能影响干扰素信号通路、病毒反应或核酸检测的基因。这类基因包含一些具有实验或计算支持其与干扰素信号通路或抗病毒通路关联的案例，但证据通常是间接的、范围有限的或未得到广泛验证的。
**类别 3：** 没有已发表文献表明其对干扰素通路有影响的基因。这类基因缺乏直接关联 I 型干扰素信号通路或抗病毒机制的文献记录、基因本体注释或实验证据。

为了独立验证筛选结果，按照上述方法将 sgRNA 添加到 iPSC 中（详见 lentivirus 生产部分）。sgRNA 序列见补充数据 8。

为了评估不同细胞系的 RNA 抑制程度，使用 Quick-RNA Microprep Kit（Zymo, R1050）提取 RNA，并使用 SensiFAST cDNA Synthesis Kit（Meridian Bioscience, BIO-65053）生成 cDNA。定量 PCR 采用 SensiFAST SYBR Lo-ROX 2X Master Mix（Bioline; BIO-94005）和来自 Integrated DNA Technologies 的定制 qPCR 引物（见补充数据 8）。扩增数据通过 Applied Biosystems QuantStudio 6 Pro 实时 PCR 系统及 QuantStudio Real Time PCR 软件（v.1.3）进行定量分析，表达变化倍数通过 ??Ct 方法计算，并以管家基因 GAPDH 作为基准进行归一化。

**RNA 测序：**
在分化第 8 天，iPS-Microglia 细胞分别被处理 10 pM 或 100 pM 的 IFNβ。第 9 天，使用 TrypLE 在 37 °C 下消化 iPSC 10 分钟。RNA 通过 Quick-RNA Miniprep Kit（Zymo, R1055）分离。为了识别对 IFNβ 有响应的基因，根据制造商说明书使用 QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit for Illumina FWD（Lexogen, 015UG009V0252）制备 RNA 测序文库。文库扩增共进行 11 个 PCR 循环。在 CNOT10 削减后分析分化表达情况时，按照制造商说明书使用 PIP-seq 3’ Single-Cell RNA kit v3.0 进行单细胞测序，测序设备为 Illumina NextSeq-2000。

转录本通过 Salmon v.1.4 对齐到人类参考基因组（GRCh38，版本 42）。使用 tximeta 将转录本映射到基因并进行量化。仅保留计数至少为 2,500 的细胞，选取突变最显著的 5,000 个基因（每个基因至少有 10 次共享计数）。接着将细胞值归一化到 10,000 的总和并对其进行对数转换。随后利用这些高变异基因进行主成分分析（PCA），再通过前 15 个主成分计算每个细胞的最近邻居。所有单细胞筛选、转换和降维操作均使用 ‘scanpy’66 完成。

为了测量细胞中的扰动效应，我们首先通过寻找每个细胞的 20 个最近非靶向细胞计算扰动特征，并消除技术性变异，以便揭示特定扰动的影响。该操作使用 Satija 实验室开发的 ‘Mixscale’ 包中的 CalcPerturbSig() 函数完成，结果保存在 ‘Seurat’ 中的 PRTB 分析中。接着使用 Wilcoxon 积分检验（‘presto’ 包：https://github.com/immunogenomics/presto，基于 Seurat v5 的实现，但使用了自定义的 ‘Mixscale’ 版本：https://github.com/reetm09/mixscale）进行 CNOT10 削减组与非靶向对照组之间的差异表达分析。在调整后，P 值小于 0.05 的差异表达基因（DEGs）被视为显著基因。

我们利用前 500 个显著 DEGs 来量化每个细胞相对于非靶向对照组的表达变化幅度。具体方法是为 CNOT10 削减组和对照组各选取相同数量的细胞，构建扰动向量（向量长度等于识别的 DE 基因数量），并使用 PRTB 分析得到的表达值。通过计算两组细胞扰动向量的平均差异，将每个细胞的扰动向量投影到差异向量上以获得扰动分数。这些标准化后的 Mixscale 分数用于负二项回归 DE 分析（Run_wmvRegDE() 函数），以加权各细胞在 DE 基因识别中的贡献。最终选出的 DEGs 列表用于后续分析，包括火山图和功能解析。