左心室舒张功能的血浆蛋白质谱

《Scientific Reports》：The plasma protein profile of left ventricular diastolic function

　　摘要
本研究旨在通过两项基于人群的研究，探讨血浆蛋白与左心室（LV）舒张功能指标之间的关联。在基于人群的研究PIVUS（n=1,016；所有参与者年龄为70岁）和POEM（n=502；所有参与者年龄为50岁）中，使用邻近延伸测定法（PEA）和超声心动图技术检测了86种与心血管相关的水血浆蛋白。PIVUS作为发现队列，应用Benjamini-Hochberg程序将假发现率（FDR）控制在0.05以下。POEM作为重复队列。研究发现，这些血浆蛋白与舒张期超声心动图参数存在关联。仅在POEM队列中，进一步分析了1,322种血浆蛋白。在86种蛋白中，有7种蛋白与E/A比值存在显著关联：CD40配体（CD40LG）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、热休克蛋白β-1（HSPB1）、表皮生长因子（EGF）、TNF超家族成员14（TNFSF14）、血管内皮生长因子D（VEGFD）和内皮细胞特异性分子1（ESM1）。利用POEM队列中更广泛的蛋白分析范围，共有81种蛋白与E/A比值存在显著关联，另有5种蛋白与左心房直径存在显著关联。这些发现有助于深入了解左心室舒张功能，并为未来药物开发提供了潜在依据。

引言
射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）在全球范围内构成了巨大的疾病负担，约占总心力衰竭病例的50%，也约占与心力衰竭相关住院病例的一半。然而，HFpEF的病理生理机制仍不甚明了。左心室舒张功能可通过经胸超声心动图（TTE）进行评估。英国超声心动图学会发布的最新指南强调了评估舒张功能的关键指标：E/A比值（早期二尖瓣流入速度与二尖瓣环速度之比）、TR速度（三尖瓣反流的最大速度）以及左心房容积。早晚期舒张充盈关系（E/A比值）和等容舒张时间（IVRT）也可以作为舒张功能的补充指标。较低的E/A比值和延长的IVRT提示心肌舒张功能障碍（在充盈压正常的条件下）。

先前的研究调查了248种炎症蛋白与228名HFpEF患者之间的关联，这些患者同时患有高血压、肥胖和糖尿病等常见并发症。研究发现，炎症蛋白在HFpEF患者中上调，且与心脏功能异常相关，支持了“并发症-炎症”假说。另一项研究评估了459种HFpEF患者的蛋白表达，并在外部队列中验证了其中29种与HFpEF相关的生物标志物，这些标志物涉及纤维化、炎症、心脏重塑和代谢过程，以及与患者预后（住院率和全因死亡率）的关联。还有一些研究比较了不同射血分数（EF）患者之间的血浆蛋白水平差异。例如，Adamo等人研究发现HFpEF、HFrEF和轻度EF降低的心力衰竭患者血浆蛋白水平存在差异。Andrzejczyk等人比较了健康成人、HFpEF和缺血性HFrEF患者的4210种血浆蛋白表达，发现NELL2（Neural EGFL-Like 2）和SLITRK6（SLIT And NTRK Family Member 6）在HFpEF患者中的水平较低。

在基于人群的研究中，很少有研究探讨血浆蛋白与左心室舒张功能障碍之间的关联。在比利时的一项基于人群的研究中，575名参与者（18%具有舒张功能障碍）接受了PEA和TTE的蛋白组学分析，结果显示炎症、肾功能、细胞外基质重塑和血管生成相关通路与早期心力衰竭相关，并发现某些特定蛋白与舒张功能障碍相关，但结果未在独立队列中得到验证。

研究目的
尽管已在HFpEF中探索了血浆蛋白组学，但很少有基于人群的研究评估其与社会舒张功能指标之间的关联。本研究首次将血浆蛋白组学与左心室舒张期超声心动图参数联系起来，并在独立队列中验证了研究结果。

方法
乌普萨拉老年人血管前瞻性研究（PIVUS）旨在探究评估内皮功能是否有助于提高心血管风险预测能力。研究从乌普萨拉县的人口登记册中随机选取了1,016名70岁参与者（其中50%为女性），他们在2001至2004年间接受了多项检查，包括TTE和蛋白组学分析。所有参与者在纳入研究前均签署了书面知情同意书。
肥胖、能量与代谢前瞻性研究（POEM）旨在探讨心血管疾病（CVD）与肥胖之间的关联，方法类似，从乌普萨拉县的人口登记册中随机选取了502名50岁参与者（其中50%为女性），他们在2010至2016年间接受了包括TTE和蛋白组学分析在内的多项检查。所有参与者在纳入研究前均签署了书面知情同意书。
在PIVUS和POEM研究中，使用Olink Proteomics AB公司的CVD-1心血管蛋白组学试剂盒通过PEA检测了92种血浆蛋白。排除了检测值低于检测限（LOD）70%的蛋白。在剩余的86种蛋白中，有6种的检测重现率低于70%，因此最终分析了86种蛋白。
首席研究员Lind博士使用Acuson XP124心脏超声仪（美国加州Acuson公司）和2.5 MHz探头进行了所有TTE检查。虽然TTE包括收缩功能与几何结构的评估，但本研究仅分析了舒张期参数：E/A比值、IVRT和左心房直径。
为避免E/A比值和IVRT的假正常化，排除了左心室射血分数（LVEF）低于50%的参与者。在PIVUS的1,016名参与者中，1,003名进行了蛋白组学分析；其中60名因LVEF低于50%被排除。在POEM研究中，所有参与者的LVEF均大于50%，仅有一名因缺乏蛋白组学数据而被排除。研究的流程图见图1。

结果
在PIVUS中，86种血浆蛋白中有19种与E/A比值存在显著关联。在调整年龄和性别后，这些蛋白中有15种在POEM研究中仍然显著；进一步调整心血管风险因素后，仍有7种蛋白保持显著性（见图2）。
在仅限于POEM队列的更广泛蛋白分析中，经过Bonferroni校正后，有81种蛋白与E/A比值存在显著关联（见表2）。在POEM研究中，没有蛋白与IVRT存在显著关联。
使用Stata 16.1软件（StataCorp公司）进行统计分析，并使用R统计软件进行数据可视化。Olink Insight（Olink Proteomics AB）用于分析蛋白关联及其潜在的生物学机制。ChatGPT（OpenAI公司）用于语言编辑。

本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则，所有方法均符合相关指南和法规。瑞典乌普萨拉地区伦理委员会批准了这两项研究（PIVUS：Dnr 00/419和POEM：Dnr 2009/045）。所有参与者在纳入研究前均签署了书面知情同意书。

表1 显示了PIVUS和POEM研究中的参与者特征。在PIVUS中评估的86种血浆蛋白中，有19种与E/A比值存在显著关联。在进一步调整年龄和性别后，这些蛋白中有15种在POEM研究中仍然显著；在进一步调整心血管风险因素后，仍有7种保持显著性。

在POEM队列中，经过Bonferroni校正后，有81种蛋白与E/A比值存在显著关联（见表2）。在POEM中，没有蛋白与IVRT存在显著关联。表3列出了在POEM研究中通过Bonferroni校正的5种与左心房直径存在显著关联的蛋白。

通过线性回归模型，将所有86种蛋白分别与PIVUS和POEM中的三个舒张功能指标进行关联分析。在第一组模型中，仅调整了年龄和性别；在第二组模型中，还调整了传统风险因素（收缩压、LDL胆固醇、HDL胆固醇、糖尿病和吸烟情况）。
在PIVUS研究中与一个或多个TTE参数存在显著关联的蛋白在POEM研究中进行了重复验证，应用Benjamini-Hochberg程序将FDR控制在0.05以下。
此外，在POEM研究中还分析了包含约1,500种蛋白的Olink Explore 1536蛋白组学试剂盒。其中1,322种蛋白的检测值超过检测限75%，被用于进一步分析。这些蛋白与PIVUS中的相同舒张期TEE参数进行了比较，但未观察到重复关联。为此采用了Bonferroni校正而非Benjamini-Hochberg校正方法以降低偶然发现（假阳性）的风险。
通过在模型1中应用Bonferroni校正后的p值（0.000038）和在模型2中应用p值<0.05的蛋白被认为是显著的。

结论
本研究首次将血浆蛋白组学与左心室舒张期超声心动图参数联系起来，并在独立队列中验证了研究结果。此外，在对更广泛的蛋白质组进行探索性分析时，我们发现了另外81种与E/A比值相关的蛋白质，以及5种与左心房(LA)直径相关的蛋白质。PREHOSP-CHF研究发现，参与淋巴管生成和血管生成的VEGFD蛋白在HFpEF（轻度心力衰竭）、HFmrEF（中度心力衰竭）和HFrEF（重度心力衰竭）患者中的水平相似。在HFpEF组中，他们发现VEGFD水平与心力衰竭住院风险增加有关。这与本研究的结果相反，本研究发现E/A比值与该蛋白呈正相关。CD40配体是一种存在于活化T细胞上的蛋白质，对免疫系统功能至关重要。据作者所知，尚未有任何研究将CD40配体与舒张功能障碍联系起来。有研究表明，急性及慢性心力衰竭患者的CD40L水平均升高。然而，该研究中LVEF（左心室射血分数）的水平低于我们研究中的参与者。由于高血压和糖尿病（HFpEF的常见合并症）患者常伴有CD40L水平升高，这可能是舒张功能障碍的一个潜在机制。

Takeishi等人发现SRC蛋白在豚鼠中因急性心肌牵拉和慢性压力负荷而激活，该蛋白在β-肾上腺素能受体的下游信号传导中起关键作用。2023年的一项动物研究表明，SRC信号传导可能介导心脏重构和纤维化，从而引发舒张功能障碍。尽管这些是动物实验数据，但其结果与我们的人类观察结果一致。HSPB1是一种应激反应伴侣蛋白，在本研究中发现其与E/A比值呈负相关。现有证据表明HSPB1在细胞应激状态下表达上调。在ULSAM队列中，对70岁无心血管疾病(CVD)的老年人进行了随访，以监测包括心力衰竭在内的事件。在心力衰竭亚组中，HSPB1与心力衰竭的发生呈正相关。另一项研究发现HSPB1水平与慢性心力衰竭患者的不良预后有关。然而，后一项研究中的平均LVEF水平低于我们研究中的参与者。

ESM1（Endocan）由内皮细胞合成，其水平与慢性心力衰竭患者的不良事件相关。尽管很难直接比较，但研究结果似乎与我们的发现略有矛盾，因为在我们的研究中，内皮蛋白水平与E/A比值呈正相关。EGF受体参与细胞存活和分裂相关通路的研究表明，EGFR敲除小鼠会出现收缩功能障碍和舒张期松弛能力受损。相反，一项针对肥厚型心肌病(HCM)患者的研究发现EGF受体激活会加重松弛障碍。小鼠模型显示EGFR信号传导与舒张功能障碍之间存在因果关系。而在人类研究和本研究中则观察到相反的相关性，这可能反映了EGFR信号传导与舒张功能之间的复杂关系。在本研究中，促炎细胞因子TNFSF14/LIGHT与E/A比值呈负相关。Dahl等人认为TNFSF14在慢性心力衰竭的进展中起作用。然而，该研究采用了LVEF<35%、等待移植的人类心脏样本。最近的一项小鼠研究发现TNFSF14会促进心房颤动和心房纤维化，这是舒张功能障碍的常见并发症，这可能解释了两者之间的关系。因此，LIGHT与舒张功能之间的关联尚未得到充分证实，因为尚无人类研究直接探讨这一联系。

在本研究的探索性部分，共有81种蛋白质的p值低于Bonferroni校正阈值（p<0.000038），表明它们与E/A比值相关。其中5种蛋白质与左心房直径显著相关，这一点值得注意。但由于单独的左心房直径对于明确评估舒张功能来说不够特异，因此这里不再进一步探讨这些发现。在这81种蛋白质中，有几个在临床前研究中已被证实与舒张功能有关。根据现有文献，有几个蛋白质被认为与人类左心室舒张功能相关。Füth等人研究了活化血小板产生的P-Selectin蛋白在舒张功能中的作用，发现舒张功能障碍患者的P-Selectin水平较高，且这种关联不受糖尿病或冠状动脉疾病的影响。这些患者接受了经胸超声心动图(TTE)检查，平均EF（射血分数）为68%。组织型纤溶酶原激活剂(tPA)能够通过将纤溶酶原转化为纤溶酶来促进血栓分解。Winter等人证明tPA/PAI-1复合物可独立预测HFpEF患者的全因死亡率和心脏死亡率。另一项研究发现tPA水平升高以及其他促凝标志物升高，表明HFpEF与促凝状态有关。腺苷酰高半胱氨酸酶是高半胱氨酸的前体，多项研究将其水平与舒张功能障碍联系起来。在一项包含约6700名患者的研究中，高半胱氨酸水平与心力衰竭（尤其是HFpEF）有关。另一项研究发现HFpEF患者的高半胱氨酸水平高于对照组。

在本研究中，只有SRC蛋白同时出现在探索性和验证性部分发现的7种蛋白质中。将我们的结果与最近发表的英国生物银行（UK Biobank）蛋白质组学研究进行比较，发现探索性和验证性部分发现的7种重要蛋白质中有2种（TNFSF14和VEGFD）也出现在与心力衰竭相关的683种蛋白质列表中。在更大的蛋白质组中，另有14种蛋白质也出现在该列表中：DPY30、FKBP4、FURIN、ITGA5、LBR、PLAT、PRCP、PTPN1、RARRES2、SCGB3A2、SIGLEC1、TMSB10、TPP1和TYMP。据我们所知，类似的研究非常少。Cauwenberghs等人研究了基于人群的队列中舒张超声心动图参数与蛋白质组学之间的关联，但他们的研究缺乏独立的验证队列。他们测量了多种舒张参数，包括E/A比值和左心房体积，但没有测量IVRT（左心房收缩时间）。有趣的是，他们发现的蛋白质谱与我们研究中的不同。

本研究中的70岁参与者平均IVRT为121毫秒，50岁参与者为88毫秒，平均E/A比值分别为0.96和1.5。50岁组中较高的E/A比值和较低的IVRT表明年轻人群的心脏硬度较低，这些数值符合相应年龄段的预期。本研究的优势在于少数研究将上述蛋白质与左心室舒张功能进行了比较；此外，还在外部队列中进行了验证。所有TTE检查均由同一经验丰富的临床医生完成，并使用了两种不同的蛋白质组进行蛋白质分析。本研究的局限性在于仅发现了E/A比值的相关性，未能发现IVRT与左心房直径之间的关联。尽管如此，E/A比值是最可靠的指标，因为它受观察者间变异影响小，且能在图像质量不佳的情况下获得。另一个局限是未测量其他舒张期超声心动图参数，如E/e’和TR速度。由于研究对象包括50岁和70岁的志愿者，因此难以确定这些结果是否适用于更广泛的人群。

本研究的优势还包括在基于人群的队列中研究上述蛋白质与左心室舒张功能的关系，并在外部队列中进行了验证。此外，所有TTE检查均由同一临床医生完成，蛋白质分析使用了两种不同的蛋白质组。然而，由于未发现IVRT与左心房直径之间的关联，这可能被视为一个局限性。尽管如此，E/A比值是最可靠的指标，因为其受观察者间变异最小，且能在图像质量不佳的情况下获得。研究的另一个弱点是未测量其他舒张期超声心动图参数。鉴于研究对象主要为50岁和70岁的志愿者，目前尚不清楚这些结果是否适用于更广泛年龄段的人群。基于人群的设计既可能是我们研究发现对HFpEF患者相关性的限制，也可能是其优势，因为这些蛋白质变化可能与舒张功能障碍的早期迹象相关。

本研究是少数探讨蛋白质组学与左心室舒张功能关系的研究之一，并在外部队列中进行了验证。与舒张充盈模式相关的主要通路包括信号转导、代谢和免疫系统通路。值得注意的是，我们发现了一些与先前研究中的舒张功能障碍或HFpEF相关的蛋白质，包括在探索性和验证性队列中得到验证的蛋白质（Src、EGF），以及在更广泛探索性组中发现的蛋白质（P-Selectin、tPA和AHCY）。这项研究有助于深入了解舒张功能障碍的病理生理机制，为未来药物开发提供了潜在方向。