多变量合成优化、全面表征以及钯纳米粒子的表面配体测定

《Scientific Reports》：Multivariate synthesis optimization, comprehensive characterization, and surface ligand determination of palladium nanoparticles

　　摘要
我们提出了一种高通量的钯纳米粒子（PdNPs）合成方法，这些粒子在工业过程中被广泛用作催化剂。该方法采用水作为反应介质，并借助一个商用反应平台，在相同条件下实现多个反应的同时进行。通过Doehlert实验设计，确定了最佳的合成条件，包括反应温度以及Pd、硫醇配体（3-巯基丙酸（MPA）和L-半胱氨酸（Cys）和还原剂的浓度。纯化的硫醇修饰PdNPs通过透射电子显微镜（TEM）、能量色散X射线光谱（EDS）、动态光散射（DLS）和纳米粒子追踪分析（NTA）进行了表征，证实了形成了形状不规则的PdNP-MPA和PdNP-Cys，其多分散指数高达0.270。单粒子电感耦合等离子体质谱（sp-ICP-MS）能够测定粒径和粒度分布，证明了该方法适用于表征具有不规则形状的多分散纳米粒子，并且其结果与TEM和NTA得到的结果一致。批量ICP-MS用于通过硫与钯的比值来确定硫醇配体的表面密度。总体而言，本研究展示了多变量实验设计在PdNP合成中的潜力，以及互补分析技术在全面表征纳米粒子方面的价值。

引言
通过配体设计的工程纳米材料（NMs）具有定制的结构和表面化学性质，在医学诊断1、能源储存与转换3、光电技术4、催化作用5、环境污染物去除6和化学改性7等领域得到了越来越多的应用。例如，银、金和钯等金属纳米粒子（NPs）可以生产成不同的尺寸、形状和表面化学性质11。然而，基于钯的纳米粒子（PdNPs）尤为突出，已成功应用于环境分析中，例如使用石墨炉原子吸收光谱法测定石油废水浸出液中的Pb7，以及使用分子吸收光谱法对煤样中的硫进行分级8。PdNPs还表现出作为Suzuki-Miyaura交叉偶联反应催化剂的高效率、选择性醇类氧化能力和将Cr(VI)还原为Cr(III)的能力，同时还展现出优异的抗菌和抗生物膜活性12。尽管可以通过成熟的物理或化学方法合成NPs，特别是PdNPs10，但仍然需要寻求使用低毒性试剂和稳定剂的更可持续、更环保的方法12,13。通过传统的单变量方法优化多个参数来合成定制的NPs通常耗时较长且需要大量实验14,15。这些方法通常不可持续，因为它们消耗大量能源和化学物质，并导致废弃物产生。因此，多变量优化方法非常具有吸引力且环保，能够在较少的实验次数下有效优化定制的NPs，并最大化获得的信息量14,16,17。通过将多变量优化方法与能够并行进行多种反应的合成设备结合使用，可以更快地筛选出主要的关键参数，同时减少实验次数。例如，分馏因子设计方法可以实现这一点，而响应面方法（如Doehlert设计）则可以确定获得NPs的最佳实验条件15,18。

除了合成之外，定制NPs的广泛应用1,2,3,4,5,6,7,8也突显了NPs表征的重要性，特别是在尺寸、形状、粒子数浓度（PNC）、组成和化学表面等方面，这对于理解它们的吸收、命运、传输和毒性效应至关重要，同时也提高了NMs的安全设计概念19。因此，用于全面表征NPs的互补分析方法对于质量控制评估以及避免这些NPs的有害效应是必不可少的20。已经采用了多种分析技术来表征NPs的尺寸、形状、PNC、组成和表面性质21。其中，动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子追踪分析（NTA）、非对称流场流分级（AF4）、小角X射线散射（SAXS）、单粒子电感耦合等离子体质谱（sp-ICP-MS）、粒子诱导X射线发射（PIXE）21,22,23,24等方法已经得到广泛应用。此外，表面等离子体共振（SPR）25、傅里叶变换红外光谱（FTIR）26和磁共振光谱（NMR）分析27可以用于研究表面相关性质和粒子配体相互作用。对于用含有杂原子的化合物（如S和P）功能化的金属NPs，通过批量ICP-MS分析可以成功测定配体密度，同时监测金属核心和与表面配体结合的杂原子28。此外，还采用了光学测定、电位法和热重法来量化不同NPs的表面基团27,29,30。然而，由于许多NPs表征分析方法基于假设粒子为球形和/或单分散的模型，因此表征多分散和形状不规则的NPs仍然是一个挑战。

在这方面，我们提出了一种多方法组合来对金属NPs进行互补表征。鉴于PdNPs在催化和工业过程中的广泛应用以及其在环境中的重要性7,8,10,12，我们使用商用多合成方法合成了用MPA和Cys修饰的PdNPs，并将其作为NPs互补表征的概念验证粒子。所提出的合成方法是在水相中进行的，通过多变量优化来确定最佳的合成条件。

结果与讨论
所提出的PdNPs合成方法是一种环保的替代方案，特别是当与商用多合成设备和多变量优化结合使用时，可以减少试剂消耗和实验废弃物。优化这些参数对于促进可分析且标准化的PdNPs合成过程非常重要，能够最小化尺寸分布的不受控制的扩展。图1中的工作流程概述了硫醇修饰PdNPs的合成和表征过程。
图1
PdNP-MPA和PdNP-Cys的合成工作流程，包括去除未结合配体的纯化过程，以及采用多分析方法进行表征和配体密度评估。

合成的PdNPs经过彻底纯化以去除未结合的配体，然后通过互补分析技术对其尺寸、粒度分布、形状、PNC和组成进行了表征。总Pd和S浓度通过ICP-MS测定。测得的浓度用于确定PdNPs表面的硫醇配体密度。

使用多变量优化进行纳米粒子合成
首先通过分馏因子设计25?1来筛选NPs合成的关键参数（p < 0.05）以及参数在评估范围内的潜在相互作用，随后采用响应面方法（Doehlert设计）进行优化。应用的2??1设计矩阵及其相应的响应（1–PDI）见表1。如观察到的，为了评估实验的不确定性和重复性，中心点进行了三次重复实验，从而最小化了实验总数并保持了模型的统计稳健性。
表1 使用3-巯基丙酸（MPA）作为配体的PdNPs合成参数筛选的2??1分馏因子设计的实验、实际值和编码值（括号内所示）。

考虑到95%的置信水平，通过方差分析（ANOVA）和Pareto图（图S1）评估了选定参数及其相互作用的效果。表S1显示了25?1因子设计的评估参数的显著效应和决定系数（R2）。反应时间、温度以及Pd、配体和还原剂的浓度及其大多数相互作用对所得PdNPs的尺寸、粒度分布和形状没有显著影响。此外，温度和Pd浓度之间的相互作用对合成PdNPs的PDI有显著的正效应（p < 0.05），这表明最佳合成条件可能位于评估范围内。因此，由于温度和Pd浓度之间的相互作用具有显著效应，采用了响应面方法（Doehlert设计）来确定PdNPs的最佳合成条件。应用的Doehler设计矩阵及其基于1–PDI的相应响应见表2。
表2 使用3-巯基丙酸（MPA）和L-半胱氨酸（Cys）修饰的PdNPs合成的Doehlert设计的实验、实际值和编码值（括号内所示）。

对于Doehlert设计优化，评估了温度和Pd浓度对合成的PdNP-MPA和PdNP-Cys的PDI的影响。图2显示了使用Doehlert设计优化得到的（A）PdNP-MPA和（B）PdNP-Cys的等高面图以及相应实验条件1和5的TEM图像。
图2
使用Doehlert设计优化在实验1和5条件下获得的纳米粒子的等高面图和TEM图像。表面上的数字对应于Doehlert设计的实验次数。颜色范围从绿色（较高PDI）到红色（较低PDI）。

对于两种PdNPs（表S2和S3），ANOVA显示在考虑的范围内评估参数没有显著效应。这些结果表明，Doehlert设计实验中使用的任何条件都可用于PdNPs的合成。然而，比较在温和温度和低Pd浓度（60°C，实验1）下合成的PdNPs与在高温和高Pd浓度（80°C，实验5）下合成的PdNPs的TEM图像，后发现后者条件下聚集现象更明显，较小粒子附着在较大粒子的表面。另一方面，在实验1条件下，较小粒子的浓度略有减少，使得粒子更加均匀。因此，由于无法明确定义最佳条件，选择了以下折中的实验条件来合成PdNPs：10 μmol的Pd，0.15 mmol的抗坏血酸作为还原剂，0.08 mmol的配体（MPA或Cys），反应温度为60 ± 3°C，持续90分钟。之后，将获得的PdNPs进行纯化步骤以去除未结合的配体，通过洗涤循环进行，同时监测超滤液中的S浓度（图S2）。从第6次到第8次洗涤循环，洗涤上清液中的S浓度没有显著变化（Anova，95%置信水平）。因此，进行了六次洗涤循环以去除未结合的配体。这与Elzey等人关于去除硫醇修饰金纳米粒子上未结合配体的研究结果一致31。

总的来说，多变量优化结合多合成装置的应用能够有效定义PdNPs的合成条件，并通过减少实验次数来评估参数之间的相互作用。在这些合成条件下，纳米粒子尺寸分布的不受控制扩展被最小化，从而实现了标准化的PdNPs合成过程。与使用单变量优化和单批次反应系统的传统方法相比，多变量优化和多合成方法显著减少了确定合成条件所需的实验次数。因此，这种方法减少了试剂消耗、能源消耗和废弃物产生，符合绿色化学的原则。

结构和组成
通过TEM/EDS分析对用MPA和Cys修饰的合成PdNPs的形态和组成进行了表征。图3展示了合成的PdNPs中Pd和S的TEM图像和元素映射。
图3
使用MPA和Cys修饰的PdNPs的TEM图像和EDS映射。

如TEM图像所示，PdNP-MPA和PdNP-Cys样品都含有不同尺寸和形状的纳米粒子。测得的PdNP-MPA和PdNP-Cys的平均尺寸分别为96 ± 33 nm和71 ± 30 nm。由于观察到了混合形状（如立方八面体、截角八面体、准球形等）以及一些多核粒子，因此难以定义这两种合成PdNPs的形状。考虑到所采用的水基合成方法和L-抗坏血酸作为还原剂，Pd离子的快速还原可能促进了热力学上有利的物种（如截角八面体和多孪晶粒子）的形成32。因此，在所应用的合成条件下，TEM图像表明纳米粒子的生长是不均匀的。

Pd和S的元素映射显示了这两种PdNPs中这些元素的分布。在纳米粒子外部区域没有检测到显著的S和/或Pd含量，表明没有大量的Pd离子或未结合的配体存在。正如预期的那样，两种合成PdNPs的元素映射显示Pd在每个粒子中均匀分布。PdNP-MPA和PdNP-Cys中S的分布与纳米粒子区域完美重叠，表明硫醇基配体实现了有效的均匀表面覆盖。通过EDS分析，还估算了PdNPs表面硫（S）的浓度。分析在两个到三个纳米粒子区域进行，发现两种PdNPs中的硫浓度相当：PdNP-MPA（0.21 ± 0.11%（重量百分比）和PdNP-Cys（0.14 ± 0.11%（重量百分比））。尽管这些结果可能存在较高的不确定性，但它们证实了粒子表面存在硫。此外，这些结果与通过批量ICP-MS分析获得的结果一致，后者用于评估粒子表面总硫浓度以确定配体密度。作为作者的预测，我们相信未来的研究中，“两侧”将会紧密联系在一起：自动化的纳米粒子（NPs）合成将包含一个封闭的反馈循环，并以互补的多技术分析作为支撑。实验部分涉及使用分析级别的试剂和溶液，这些试剂未经进一步纯化即可使用。用于标准酸化和纳米粒子分解的试剂包括双蒸硝酸（HNO3，65%（重量%），Merck公司，德国达姆施塔特；以及盐酸（HCl，37%（重量%），Merck公司）。在纳米粒子合成过程中，使用了K2PdCl4（99.99%，Sigma-Aldrich公司，美国圣路易斯）、L-抗坏血酸（>99.5%，Sigma-Aldrich公司）、L-半胱氨酸（Cys，>98%，Sigma-Aldrich公司）和3-巯基丙酸（MPA，98%，Sigma-Aldrich公司）。作为内标，使用了Pd 1,000 mg L^-1、Pt 1,000 mg L^-1、S 1,000 mg L^-1和Rh 1,000 mg L^-1的标准溶液（Sigma-Aldrich公司）。

**钯纳米粒子（PdNPs）的合成与表面修饰**
PdNPs的合成遵循He等人2009年和Lim等人2009年的方法，并进行了一些修改，其中使用了抗坏血酸作为还原剂，MPA和Cys作为表面稳定配体。为了加快PdNP的合成速度，采用了Radleys Core+多功能实验装置（Radleys公司，英国Saffron Walden），该装置配备了搅拌装置（Starfish，来自德国Heidolph Schwabach公司），能够同时从不同反应混合物中以相同的搅拌速度和温度合成多达40批样品。通过完整的25^-1因子设计对合成参数进行了优化，以评估以下参数的重要性：Pd（2–16 μmol）、配体（MPA）（0.02–0.14 mmol）和还原剂（0.05–0.25 mmol）浓度、反应时间（30–180分钟）以及反应温度（25–75°C）。评估参数的水平及其在多变量分析中所需的编码值见补充信息中的表S7。考虑到L-抗坏血酸对Pd快速还原的作用，为了获得可重复、可分析且标准化的合成流程，通过多分散性指数（PDI）评估了优化参数的影响和相互作用。此外，为了通过多变量优化中的数学模型获得最大响应面，并便于解释响应面，将PDI值转换为1-PDI（表1）。然后通过Doehlert设计优化确定了PdNPs的最佳合成条件。Doehlert设计的代码和变量用于MPA和Cys封端的PdNPs的合成，见表2。

**在特定条件下获得PdNPs的方法**：
对于MPA封端的PdNPs（PdNP-MPA），将150 μL浓度为1.0 mol L^-1的抗坏血酸溶液（0.15 mmol）稀释在2.05 mL超纯水中，在60±3°C下加热并搅拌700 rpm，加入156 μL浓度为0.064 mol L^-1的K2PdCl4（10 μmol），继续反应10分钟。随后加入143 μL浓度为0.56 mol L^-1的MPA（0.08 mmol），并在60±3°C下继续搅拌80分钟。对于Cys封端的PdNP（PdNP-Cys），过程与上述相同，但抗坏血酸（0.15 mmol）在2.03 mL超纯水中稀释，然后加入161 μL浓度为0.50 mol L^-1的Cys（0.08 mmol）作为配体。

**PdNPs的纯化**
所得的PdNP-MPA和PdNP-Cys通过六次清洗循环去除未结合的配体。将2.5 mL的合成PdNP胶体悬浮液置于超声浴中（Allpax，PTIC-5-LA，120 W，50 Hz）中超声处理2分钟，然后转移到使用再生纤维素膜的Amicon超滤器中（截断分子量为10 kDa，Merck公司），并以7,000 rcf离心10分钟（Eppendorf型号5810R），去除上清液。接着向样品中加入2.5 mL超纯水并再次离心（7,000 rcf，10分钟）。这个步骤重复6次。之后将纯化的PdNP-MPA和PdNP-Cys重新分散在2.5 mL超纯水中，粒子中的S浓度归因于表面结合的配体。为了提高PdNPs从过滤膜中的回收率，在转移到Amber储存瓶之前，样品再次超声处理1分钟。

**透射电子显微镜（TEM）分析**
PdNP-MPA和PdNP-Cys的表征使用JEOL JEM-2100 F-UHR显微镜进行，该显微镜配备场发射枪，在200 kV下操作，并配备了能量分散光谱（EDS）系统。将10 μL预先超声处理2分钟并稀释3次的PdNPs悬浮液滴在碳涂层的铜网（Merck公司，200目）上，并在室温下风干过夜。图像处理使用ImageJ软件（版本1.54，https://imagej.org）进行，至少考虑200个粒子来获得平均粒度和粒径分布。

**动态光散射和Zeta电势测量**
PdNP-MPA和PdNP-Cys的动态光散射（DLS）和Zeta电势测量在25°C下使用Zetasizer Nano ZS（Malvern Panalytical Ltd）进行，后散射角为173°，配备633 nm激光器，通过一次性池进行测量。测量重复三次，考虑Z平均值和数量分布来确定流体动力学直径。使用Einstein–Smoluchowski理论结合折射率1.33来计算粒子的电泳迁移率，从而确定Zeta电势。

**纳米粒子跟踪分析（NTA）**
使用NanoSight LM10（Malvern Panalytical，英国）进行纳米粒子跟踪分析（NTA），该设备配备sCMOS相机和蓝色405 nm激光器，用于确定基于数量的流体动力学直径（dh,0）和粒子数浓度（PNC）。所有测量均在25°C下以静态模式进行，数据分析使用NanoSight NTA软件（版本3.32），捕获了5段每段60秒、每秒25帧的激光光散射视频，并手动调整快门和增益。

**批量ICP-MS和单粒子ICP-MS分析**
通过ICP-MS（Agilent 8900，Agilent Technologies，日本）测定PdNP-MPA和PdNP-Cys中的S和Pd总浓度，该仪器配备石英喷雾室和MicroMist雾化器。样品通过王水分解后进行测量。具体步骤为：将1 mL的胶体悬浮液以13,000 rpm离心10分钟（Sigma公司，型号1–14 K），去除950 μL上清液，然后向沉淀的纳米粒子中加入200 μL新鲜制备的王水。混合物在室温下超声处理15分钟，纳米粒子分解后加入750 μL超纯水。样品分别稀释250倍和20,000倍以测定S和Pd浓度。校准使用浓度范围为0.1至50 μg L^-1的水溶液，以Rh（2 μg L^-1）作为内标。测量在四极杆模式下进行，Pd的Q1和Q3设置为m/z 105，S的参数分别设置为m/z 32（Q1）和m/z 48（Q3），停留时间为100 ms。CRC分别使用He（5.5 mL min^-1）和O2（0.3 mL min^-1）进行加压。

**sp-ICP-MS测量**
sp-ICP-MS测量的停留时间为100 μs，总采集时间为180秒。通过测量已知粒径（50 nm）的铂纳米粒子（PtNPs）以及离子标准品（Pt浓度为1 μg L^-1）和空白溶液（含有1%（v/v）HCl（37%（重量%）和0.5%（v/v）HNO3（65%（重量%）））来确定传输效率（TE）。在测量前，参考PdNPs和合成的PdNPs分别超声处理1分钟，并在超纯水中稀释。Pd和S的总浓度检测限是通过连续10次空白溶液的测量并除以相应校准曲线的斜率来确定的。PdNPs的粒度和溶解浓度的检测限根据Laborda等人的方法2020年进行确定。ICP-MS和sp-ICP-MS的仪器参数及相应的检测限见补充信息中的表S8。

**配体密度评估**
PdNP-MPA和PdNP-Cys的硫醇配体密度估计基于以下假设：基于MPA和Cys单层配体与纳米粒子共价结合形成的球形结构，使用sp-ICP-MS得到的平均粒度和粒子数浓度以及ICP-MS测定的S和Pd总浓度进行计算。评估了两种方法：(A) Elzey等人提出的方法，该方法基于金属纳米粒子中硫与金属的比率来确定配体密度；(B) 基于配体与S的化学计量关系及PNC来确定配体密度。