miRNAs作为2型糖尿病患者肌肉细胞内在的表观遗传调控因子

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：miRNAs as cell-intrinsic epigenetic regulators in muscle in type 2 diabetes

　　摘要
miRNA是重要的代谢调节因子，在包括2型糖尿病（T2D）在内的疾病中，其在细胞内和分泌水平上都会发生改变。然而，这些改变在多大程度上是对体内环境因素的响应，或者在细胞内在因素的影响下发生的，目前尚不清楚。在这里，我们使用了一种“疾病在培养皿中”的模型，将来自T2D患者和健康对照者的iPS细胞分化为肌母细胞（iMyos），并对其细胞内和分泌的miRNA进行了分析。我们发现，来自T2D捐赠者的iMyos在miRNA表达和通过小 Extracellular 负粒（sEVs）/exosomes 分泌方面表现出细胞内在的改变。将miRNA预测的靶点与转录组和蛋白质组数据整合后，发现T2D iMyos中改变的miRNA与其预测靶点发生了协调变化，但对蛋白质水平的影响比对mRNA水平的影响要大得多。这种效应通过在小鼠对照iMyos中过表达miRNA得到了验证。上调的miRNA靶向与有氧呼吸、膜运输和RNA代谢相关的通路。在T2D iMyos分泌的sEVs中观察到的变化更为显著，表明T2D对miRNA的分类和释放有影响。T2D iMyos中改变的分泌miRNA的靶基因主要集中在代谢通路中，包括胰岛素信号通路和线粒体代谢通路。与此一致的是，来自对照iMyos的sEVs增强了受体人类白色脂肪细胞的葡萄糖摄取和线粒体功能，而来自T2D iMyos的sEVs则没有这种效果。

引言
骨骼肌是人体最大的器官之一，是胰岛素控制血糖的主要场所。在骨骼肌中，胰岛素促进葡萄糖摄取，促进糖原和蛋白质合成，并抑制蛋白质降解。2型糖尿病（T2D）中骨骼肌代谢的功能障碍是全身胰岛素抵抗的主要原因，并且会在糖尿病患者的后代中先于并预测T2D的发生。我们团队最近证明，来自T2D患者或无T2D但具有胰岛素抵抗的患者的诱导多能干细胞（iPS细胞）在体外分化为肌母细胞（iMyos）后，表现出多种在体内骨骼肌中发现的缺陷，包括胰岛素信号通路受损、胰岛素刺激的葡萄糖摄取减少以及线粒体呼吸减弱。因此，体外培养的T2D iMyos中观察到的胰岛素抵抗现象反映了体内肌肉胰岛素抵抗的许多特征，但排除了可能混淆结果的循环因素的影响。胰岛素抵抗的细胞内在驱动因素可能包括遗传和表观遗传因素，如DNA序列的变化、DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA（包括miRNA）水平的变化。事实上，miRNA是mRNA和蛋白质水平的主要调节因子，并已被证实参与调节T2D的各个方面，包括胰岛素抵抗、葡萄糖代谢和糖尿病并发症。研究表明，在T2D患者的肌肉中，miR-133、miR-206和miR-1的水平均有所下降。此外，一项近期的大型荟萃分析将miR-144、miR-29a和miR-133确定为肌肉中胰岛素信号通路、葡萄糖代谢和胰岛素抵抗的调节因子，从而参与了T2D的发病机制。另外，先前的研究显示，循环中的miRNA（如miR-122、miR-192、miR-194和miR-193）在T2D患者的血清中水平升高。miR-122可以靶向AMP激活的蛋白激酶（PRKAB1）的调节亚基、白细胞介素1型受体和NF-kB亚基，可能促进胰岛素抵抗的发病机制。同样，miR-192已知可以靶向转录因子RFX6，后者调节胰岛形成和胰岛素产生；而miR-194可以靶向RUNX1、FOXA1、AKT和GSK3，这些因子都参与肌肉中的代谢过程。此外，循环中升高的miR-193b水平与T2D患者的肌肉质量呈负相关，表明它参与了T2D中的肌肉功能障碍。这可能是通过miR-193b抑制Pdk1表达来实现的，从而导致Akt/mammalian target of rapamycin (mTOR)/p70S6激酶（S6K）信号通路的失活，进而减少蛋白质合成。

在当前研究中，我们采用“疾病在培养皿中”的方法，使用来自健康对照者和T2D患者的iPS细胞在体外分化为肌母细胞（iMyos），并进行了敏感的核酸酶保护实验来评估细胞内和分泌的miRNA的表达谱。我们发现，在T2D的iMyos中，有22种miRNA显著上调，49种miRNA下调。将这些miRNA的预测靶点与基因和蛋白质表达数据重叠后，表明这些miRNA可能导致超过200种蛋白质的表达改变。有趣的是，在大多数情况下，mRNA水平几乎没有变化。这一现象可以通过使用miRNA模拟物在体外重现。我们还发现，在T2D iMyos中，miRNA的分泌也发生了细胞内在的改变，其中大部分改变独立于细胞内miRNA含量的变化。总体而言，这些数据表明miRNA可能在T2D的骨骼肌中作为蛋白质表达的重要表观遗传调节因子，并可能通过分泌的miRNA在远处组织中产生额外系统效应。

结果
**T2D中细胞内miRNA表达的改变**
为了在不受系统因素干扰的情况下识别T2D中骨骼肌胰岛素抵抗的细胞内在驱动因素，我们从T2D患者或健康对照者中获得了iPS细胞系，并在体外将这些细胞分化为肌母细胞（iMyos）（图1a）。供体患者的身份信息见补充图1a。然后使用HTG EdgeSeq核酸酶保护实验评估了细胞内和分泌的miRNA，该实验可以检测超过2000种已知的人类miRNA。总共发现71种miRNA在T2D中发生显著改变，其中22种miRNA上调，49种miRNA下调（图1b）。总体而言，下调的miRNA数量多于上调的miRNA，且变化幅度也更大。T2D iMyos中上调的miRNA包括miR-7161-3p、miR-5004-3p和miR-1272，它们的表达增加了1.8-3.0倍；而下调的miRNA包括miR-222-5p、miR-155-5p和miR-142-5p，它们的表达减少了1.9-2.3倍（图1c, d）。在T2D iMyos中，成熟miRNA及其前体的表达均上调（图1e），表明上调可能是由于转录增强而非半衰期变化所致。相比之下，对于在T2D iMyos中下调的miRNA（包括miR-222-5p、miR-155-5p和miR-142-5p），其前体水平没有变化，这表明这些下调反映了这些miRNA的加工、降解或分泌的改变，而不是转录水平的变化（图1f）。有趣的是，在T2D iMyos中上调的22种miRNA中，有2种仅在男性中显著上调（补充图1b）。同样，在T2D iMyos中下调的49种miRNA中，有24种仅在男性中显著下调，而1种仅在女性中下调，表明存在一定程度的性别差异。补充图1c, d展示了仅在T2D男性中下调的miRNA（miR-335-5p）、仅在T2D女性中下调的miRNA（miR-23a-5p）以及在男性和女性中都下调的miRNA（miR-142-5p、miR-193a-3p和miR-193a-5p）的代表性例子。重要的是，两种在T2D iMyos中最丰富的下调miRNA（miR-206和miR-133，补充图2a）也在T2D患者的肌肉中发现下调。同样，miR-194-5p在T2D iMyos中也下调（补充图2b），并且在T2D患者的肌肉中也发现下调。此外，我们观察到在T2D iMyos中miR-135a-5p的表达增加（补充图2b），这与之前对T2D患者和db/db小鼠骨骼肌活检的研究结果一致。如表1所示，几种下调的miRNA之前已被证实与胰岛素抵抗、葡萄糖代谢障碍和炎症信号传导有关。

**T2D iMyos中细胞内miRNA表达的改变**
为了确定T2D中骨骼肌胰岛素抵抗的细胞内在驱动因素，我们从T2D患者或健康对照者中获得了iPS细胞系，并在体外将这些细胞分化为肌母细胞（iMyos）（图1a）。供体患者的特征信息见补充图1a。然后使用HTG EdgeSeq核酸酶保护实验评估了细胞内和分泌的miRNA，该实验可以检测2000多种已知的人类miRNA。总共发现71种miRNA在T2D中发生显著改变，其中22种miRNA上调，49种miRNA下调（图1b）。总体而言，下调的miRNA数量多于上调的miRNA，且变化幅度更大。T2D iMyos中上调的miRNA包括miR-7161-3p、miR-5004-3p和miR-1272，它们的表达增加了1.8-3.0倍；而下调的miRNA包括miR-222-5p、miR-155-5p和miR-142-5p，它们的表达减少了1.9-2.3倍（图1c, d）。在T2D iMyos中，成熟miRNA及其前体的表达都上调（图1e），表明上调可能是由于转录增强而非半衰期变化所致。相比之下，对于在T2D iMyos中下调的miRNA（包括miR-222-5p、miR-155-5p和miR-142-5p），其前体水平没有变化，这表明这些下调反映了这些miRNA的加工、降解或分泌的改变，而不是转录水平的变化（图1f）。有趣的是，在T2D iMyos中上调的22种miRNA中，有2种仅在男性中显著上调（补充图1b）。同样，在T2D iMyos中下调的49种miRNA中，有24种仅在男性中显著下调，而1种仅在女性中下调，这表明存在一定的性别差异。补充图1c, d展示了仅在T2D男性中下调的miRNA（miR-335-5p）、仅在T2D女性中下调的miRNA（miR-23a-5p）或在男性和女性中都下调的miRNA（miR-142-5p、miR-193a-3p和miR-193a-5p）的代表性例子。值得注意的是，在T2D iMyos中下调的两种最丰富的miRNA（miR-206和miR-133，补充图2a）也在T2D患者的肌肉中发现下调。同样，我们在T2D iMyos中观察到miR-135a-5p的表达增加（补充图2b），这与之前对T2D患者和db/db小鼠骨骼肌活检的研究结果一致。如表1所示，几种下调的miRNA之前已被证实与胰岛素抵抗、葡萄糖代谢障碍和代谢组织中的炎症信号传导有关。

**T2D iMyos中miRNA表达的细胞内在改变**
为了确定miRNA表达的改变是否仅仅是胰岛素信号传导受损的结果，我们通过表达一种激酶失活的胰岛素受体突变体（InsR K1030R）在对照组iMyos中诱导胰岛素抵抗，这一点通过免疫印迹分析得到了证实（补充图3a）。对这些细胞进行2-NBDG摄取检测后发现，胰岛素刺激的葡萄糖摄取显著减少（补充图3b），证实了胰岛素抵抗表型的建立。这部分再现了T2D iMyos中的miRNA特征（补充图3c），表现为miR-135a-5p的表达增加，其预测靶基因BZW1的表达显著减少，以及其预测靶基因RHOA的表达减少（补充图3d）。因此，T2D iMyos中改变的miRNA水平保留了体内的表型特征，其中一些变化可能是胰岛素抵抗的继发结果，而其他变化可能促进胰岛素抵抗。T2D iMyos中miRNA表达的改变不太可能是由于miRNA生物合成机制的改变，因为变化仅涉及部分miRNA，并且在mRNA或蛋白质水平上，包括DICER和DROSHA在内的多个miRNA合成酶均未发生变化（补充图4a–c）。然而，一些下调的miRNA位于7号、9号、19号和X染色体上的基因组区域内的Cluster中（定义为同一10 kb区域内至少有2种miRNA）。因此，在49种下调的miRNA中，有7种位于7号染色体上，6种位于9号染色体上（图1g），表明这些miRNA可能具有共同的转录调控机制。同样，3种上调的miRNA位于9号染色体上，另有2种分别位于6号、12号、16号和19号染色体上（图1g），尽管这些miRNA不属于任何已知的miRNA簇。我们之前发现miRNA印记可能作为一种表观遗传调控机制，T2D中miRNA表达的显著改变可能是通过这些途径的破坏发生的。未来的研究需要结合等位基因特异性和表观遗传分析，在更大的样本队列中确定印记机制是否参与了T2D中观察到的miRNA表达差异。

**T2D调控的miRNA所针对的代谢基因**
为了确定T2D iMyos中miRNA表达改变可能影响哪些细胞过程，我们使用microT-CDS和TargetScanHuman（v8.0）进行了靶点分析。然后，我们将所有候选靶基因与对照组和T2D iMyos的RNA-seq和基于MS的蛋白质组数据进行了交叉参考。分析22种上调miRNA的预测靶点后发现，有127个靶基因在T2D iMyos中的蛋白质水平显著降低（图2a，左侧面板）。有趣的是，将这些数据与同一细胞的RNA-seq数据重叠后发现，只有12个靶基因在蛋白质和mRNA水平上都降低了，而3个靶基因在mRNA水平上实际上有所增加（图2a，右侧面板），这表明这些改变可能涉及mRNA翻译的调控，而不是mRNA降解。这些下调蛋白的通路分析显示，它们在与有氧呼吸、电子传递链、膜转运和RNA代谢相关的通路中富集（图2b）。图2c展示了这些下调蛋白的代表性例子及其定量结果，包括NDUFS8（线粒体复合物I的核心亚基）、IDH2（TCA循环中的线粒体酶）、TOMM20（线粒体蛋白质导入机制的关键成分）、COPB2和COG4（对囊泡转运至关重要的高尔基体相关蛋白），以及METTL14和YTHDF1（分别负责m6A RNA修饰的添加和读取）。图2显示了miRNA在T2D中预测的目标在蛋白质和mRNA水平上的变化。a显示了在iMyos中检测到的22个上调miRNA预测目标与蛋白质和mRNA的重叠情况。热图显示了T2D中也改变的预测目标在蛋白质和mRNA水平上的变化。左侧面板显示所有在T2D中减少的蛋白质（p<0.05），右侧面板显示mRNA水平的变化。水平蓝线表示蛋白质和mRNA水平都呈相同方向的变化。垂直蓝线表示同时减少的12个目标，红线表示蛋白质增加而mRNA减少的3个目标，绿线表示蛋白质减少而mRNA未减少的112个目标。b使用Enrichr数据库（Reactome）识别的生物通路，显示T2D中减少的主要通路（蓝色条形）。x轴表示-log10（FDR）。c显示了来自有氧呼吸、呼吸电子传递、膜转运和RNA代谢的代表性蛋白质的定量结果。数据以平均值±SEM显示，每组n=8（4名男性和4名女性）。*p<0.05，**p<0.01，单样本t检验。d显示了在iMyos中检测到的49个下调miRNA预测目标与蛋白质和mRNA的重叠情况。热图显示了T2D对改变的预测目标在蛋白质和mRNA水平上的影响。左侧面板显示所有在T2D中增加的蛋白质（p<0.05），右侧面板显示mRNA水平的变化。垂直蓝线表示同时增加的2个目标，红线表示蛋白质增加而mRNA减少的11个目标，绿线表示蛋白质增加但mRNA未减少的177个目标。e使用Enrichr数据库（Reactome）识别的生物通路，显示T2D中减少的主要通路（红色条形）。f显示了来自ESCRT、膜转运和RNA代谢的代表性蛋白质的定量结果。数据以平均值±SEM显示，每组n=8（4名男性和4名女性）。*p<0.05，**p<0.01，单样本t检验。同样地，对49个下调miRNA的靶点预测分析显示，其中有190个靶点在T2D的iMyos中在蛋白质水平上显著增加（图2d，左侧面板），但只有2个也在mRNA水平上增加，而有11个在mRNA水平上减少（图2d，右侧面板）。这些上调蛋白的通路分析显示，最富集的通路是与内吞体分选复合体（ESCRT）相关的通路、VEGF信号通路和RNA代谢通路（图2e）。图2f展示了这些上调蛋白的代表性例子及其定量结果，包括STAM2（参与内吞体分选和信号转导）、VPS25（ESCRT-II复合体的核心成分，对内吞体转运至关重要）、RBMX（参与剪接调控的RNA结合蛋白）、TNPO1（介导蛋白质进入细胞核的核转运受体）、ANKRD28（与磷酸酶复合体和信号传导相关的支架蛋白）和TUBA1C（对细胞骨架组织至关重要的微管结构成分）。这些蛋白代表了与细胞内转运、RNA处理和细胞骨架动态相关通路中的关键节点，它们都是我们分析中鉴定出的主要富集通路。

接下来，我们直接评估这些miRNA是否介导了靶基因/蛋白表达的变化。我们将对照iMyos转染了两种上调miRNA（miR-7161-3p和miR-1272）和两种下调miRNA（miR-222-5p和miR-30b-3p）的模拟物，并评估了它们参与的一些信号传导或代谢的靶基因（图3a，f）。在上调的miRNA中，有两种（miR-7161-3p，miR-1272）被预测为靶向METTL14，后者负责腺苷N6-甲基化；PIK3CA是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的p110α催化亚基。据报道，METTL14是T2D中RNA甲基化的主要驱动因素，而PIK3CA是肌肉中PI3K的主要亚型，在胰岛素作用中起核心作用。实际上，这两种靶基因都在iMyos中通过基于质谱的蛋白质组学方法被检测到，并且在T2D中都减少了20-25%（图3b）。尽管在对照iMyos中过表达miR-7161-3p仅导致METTL14和P110α在mRNA和蛋白质水平上发生了微小且不显著的变化，但在iMyos中过表达miR-1272导致这两种靶基因在mRNA水平上显著减少了37-45%，在蛋白质水平上减少了39-48%（图3c，d），这证明了miRNA的转录后调控作用。此外，抑制miR-7161-3p和miR-1272可以恢复METTL14在iMyos中的抑制作用（图3e）。这些结果通过萤光素酶报告基因检测得到证实，结果显示在对照iMyos中过表达miR-1272后，METTL14和PIK3CA的3’UTR报告基因表达减少（补充图5）。

为了更直接地评估这些miRNA是否介导了靶基因/蛋白表达的变化，我们将对照组iMyos转染了两种上调miRNA（miR-7161-3p和miR-1272）和两种下调miRNA（miR-222-5p和miR-30b-3p）的模拟物，并评估了它们参与的一些信号传导或代谢的靶基因（图3a，f）。在上调的miRNA中，有两种（miR-7161-3p，miR-1272）被预测为靶向METTL14（负责腺苷N6-甲基化）和PIK3CA（磷脂酰肌醇3-激酶的p110α催化亚基）。METTL14已被报道为T2D中RNA甲基化的主要驱动因素，而PIK3CA是肌肉中PI3K的主要亚型，在胰岛素作用中起核心作用。这两种靶基因都在iMyos中通过质谱蛋白质组学方法被检测到，并且在T2D中都减少了20-25%（图3b）。在对照组iMyos中过表达miR-7161-3p仅导致METTL14和P110α在mRNA和蛋白质水平上出现了微小且不显著的变化，而在iMyos中过表达miR-1272则导致这两种靶基因在mRNA水平上显著减少了37-45%，在蛋白质水平上减少了39-48%（图3c，d），这证明了miRNA的转录后调控作用。此外，抑制miR-7161-3p和miR-1272可以恢复METTL14在iMyos中的抑制作用（图3e）。这些结果通过萤光素酶报告基因检测得到证实。

在T2D的iMyos中减少的miRNA中，miR-222-5p和miR-30b-3p被预测为靶向FOXO1、ERK1/2和p38 MAPK（图3f）。转染miR-222-5p和miR-30b-3p的模拟物导致它们靶向的蛋白表达显著减少，在这种情况下，体外实验中mRNA水平没有显著变化（图3g，h）。相反，抑制miR-222-5p和miR-30b-3p可以恢复iMyos中FOXO1的抑制作用（图3i）。综合这些数据表明，在T2D的iMyos中上调和下调的miRNA对其靶蛋白的mRNA 3’UTR水平有显著影响，但在大多数情况下，mRNA水平几乎没有变化。这突显了这些变化的miRNA在独立于mRNA丰度的情况下对其靶蛋白的转录后调控的潜在作用。

大多数组织会将miRNA分泌到循环系统中，这些miRNA要么与蛋白质（如Argonaute或HDL）结合，要么存在于称为外泌体的小细胞外囊泡中。循环miRNA的变化已被确定为疾病标志物，并且也被认为可能起到疾病媒介的作用，因为这些分泌的miRNA可以被其他组织吸收并改变其功能。为了确定T2D是否改变了这种体外环境下的肌肉miRNA分泌，我们从iMyos的培养基中收集了分泌的外泌体，并使用尺寸排阻色谱法（SEC）进行了纯化（图4a）。使用纳米粒子跟踪分析（NTA）评估外泌体的数量和大小，发现颗粒直径范围为50-200纳米。T2D iMyos的培养基与对照细胞相比，颗粒浓度没有显著差异，但大小有约10%的趋势性减少（图4b）。免疫电子显微镜分析和免疫染色证实了使用经典的外泌体标记物（如CD81、CD9和CD63）对外泌体的富集（图4c）。

T2D对外泌体/外泌体内容的影响。a实验设计的示意图。iPS细胞被分化为iMyos。上清液被收集用于使用尺寸排阻色谱法（SEC）分离外泌体，随后进行纳米粒子跟踪分析（NTA）、电子显微镜观察和miRNA分析。b使用NanoSight评估外泌体的数量和大小分布。数据以平均值±SEM显示，每组n=8（4名男性和4名女性）。*p<0.05，**p<0.01，单样本t检验。c在过表达miR-7161-3p、miR-1272（c）、miR-222-5p或miR-30b-3p（g）的对照组iMyos中评估靶蛋白。d使用RT-qPCR确定过表达c miR-7161-3p和miR-1272或g miR-222-5p和miR-30b-3p的iMyos细胞中METTL14、PIK3CA（c，右侧面板）、FOXO1、ERK1/2和p38 MAPK（g，右侧面板）的相对基因表达。e在转染了抗miRNA（miR-7161-3p和miR-1272）（e）或抗miRNA（miR-222-5p和miR-30b-3p）（i）的对照组iMyos中评估靶蛋白。f在转染了抗miRNA e miR-7161-3p和miR-1272或i miR-222-5p和miR-30b-3p的iMyos细胞中定量METTL14（e，右侧面板）或FOXO1（i，右侧面板）。数据以平均值±SEM显示，每组n=3。*p<0.05，**p<0.01，单样本t检验。

在T2D的iMyos中减少的miRNA中，miR-222-5p和miR-30b-3p被预测为靶向FOXO1、ERK1/2和p38 MAPK（图3f）。转染miR-222-5p和miR-30b-3p的模拟物导致它们靶向的蛋白表达显著减少，在这种情况下，体外实验中mRNA水平没有显著变化（图3g，h）。相反，抑制miR-222-5p和miR-30b-3p可以恢复iMyos中FOXO1的抑制作用（图3i）。总的来说，这些数据表明，在T2D的iMyos中上调和下调的miRNA对其靶蛋白的mRNA 3’UTR水平有显著影响，但在大多数情况下，mRNA水平几乎没有变化。这突显了这些变化的miRNA在独立于mRNA丰度调节的情况下对靶蛋白的转录后调控的潜在作用。

大多数组织会将miRNA分泌到循环系统中，这些miRNA要么与蛋白质（如Argonaute或HDL）结合，要么存在于称为外泌体的小细胞外囊泡中。循环miRNA的变化已被确定为疾病标志物，并且也被认为可能在疾病中起媒介作用，因为这些分泌的miRNA可以被其他组织吸收并改变其功能。为了确定T2D是否改变了这种体外环境下的肌肉miRNA分泌，我们从iMyos的培养基中收集了分泌的外泌体，并使用尺寸排阻色谱法（SEC）进行了纯化（图4a）。使用纳米粒子跟踪分析（NTA）评估外泌体的数量和大小，发现颗粒直径范围为50-200纳米。T2D iMyos的培养基与对照细胞相比，颗粒浓度没有显著差异，但大小有约10%的减少趋势（图4b）。免疫电子显微镜分析和免疫染色使用经典的外泌体/外泌体标记物（如CD81、CD9和CD63）证实了外泌体的富集（图4c）。

T2D对外泌体/外泌体内容的影响。a实验设计的示意图。iPS细胞被分化为iMyos。上清液被收集用于使用尺寸排阻色谱法（SEC）分离外泌体，随后进行纳米粒子跟踪分析（NTA）、电子显微镜观察和miRNA分析。b使用NanoSight评估外泌体的数量和大小分布。数据以平均值±SEM显示，每组n=8（4名男性和4名女性）。*p<0.05，**p<0.01，单样本t检验。c从对照iMyos中分离出的外泌体用CD63、CD9和CD81抗体染色后的代表性电子显微镜图像。放大倍数下的比例尺为100纳米。d外泌体/外泌体中miRNA水平变化的火山图。红色点表示在T2D中显著增加或减少的miRNA（定义为变化倍数>1且p<0.05）（每组n=8）。e，f外泌体和细胞中miRNA水平的百分比相对于对照组。数据以平均值±SEM显示，每组n=8。*p<0.05，单样本t检验。男性用□符号表示，女性用○符号表示。基于T2D外泌体中上调的70个miRNA（g）和下调的296个miRNA（p<0.05）（h）确定的顶端生物过程。i使用荧光葡萄糖类似物2-NBDG（2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) amino)-2-deoxyglucose）评估葡萄糖摄取。在用100 nM胰岛素刺激30分钟后，比较未经处理的和用来自T2D和健康对照iMyos的等量外泌体预处理的人类白色脂肪细胞（hWA）中的2-NBDG葡萄糖摄取。数据以平均值±SEM显示，每组n=4-5。*p<0.05；进行一次方差分析（ONE-WAY ANOVA），然后使用Brown-Forsythe和Welch ANOVA检验，并通过控制FDR进行多重比较校正。j用来自对照或T2D iMyos的外泌体处理hWA。使用Seahorse细胞外 Flux分析在基础条件下和依次注射寡霉素（ATP合成酶抑制剂）、FCCP（解偶联剂）和rotenone plus antimycin A（复合体I和III抑制剂）后，评估线粒体呼吸。数据代表随时间变化的OCR曲线。数据以平均值±SEM显示。

为了确定T2D是否影响分泌外泌体/外泌体中的miRNA含量，我们使用HTG EdgeSeq系统对外泌体进行了miRNA分析。虽然T2D对外泌体数量没有影响，但在外泌体中检测到了2,081个miRNA，其中有366个miRNA发生了显著变化，T2D iMyos的外泌体中有296个miRNA减少，70个miRNA增加（图4d）。因此，与细胞内容物相比，外泌体中有更多的miRNA受到T2D的调控，表明T2D对外泌体的包装和分选有影响，这表明T2D对外泌体分泌有重要影响，独立于其对细胞miRNA的影响。实际上，在T2D中变化的外泌体miRNA中，只有两个miRNA（miR-7162-5p和miR-4654）在细胞和外泌体中都增加了，而只有三个miRNA（miR-210-3p、miR-193a-3p和miR-152-3p）在T2D的细胞和外泌体中都减少了（图4e，f）。

为了确定T2D的iMyos分泌的miRNAs可能靶向的生物过程，我们对上调或下调miRNAs的靶基因进行了通路富集分析（图4g，h）。有趣的是，对于在T2D中上调的miRNAs，最富集的靶通路是膜转运、神经元系统、RNA聚合酶II转录和受体酪氨酸激酶的信号通路，包括许多参与胰岛素信号传导的蛋白编码的mRNA，如AKT1、AKT2、ATF1和AP2B1。其他在外泌体中增加的miRNAs的预测靶通路包括生长因子受体和第二信使的信号传导和翻译后蛋白修饰，其中第一组的特定靶包括CAMK2B、AKT3和AKAP9，后者的特定靶包括ADAM10、APC、FOXK1、FOXK2和FSTL1。在T2D中减少的sEV-miRNAs靶向的基因的通路富集分析包括参与化学突触传递的通路（靶向基因包括PRKAA1、TUBA3C、MAPK1）、神经元系统（靶向基因包括NTRK3、ARHGEF7和ABCC8）以及膜转运通路（靶向基因包括PUM1、RAB7B、RHOQ、VAMP2和KIF2C）。由于这些miRNAs在T2D iMyos的sEVs中减少，因此预测这些通路在远端组织中会上调。有趣的是，许多在T2D iMyos分泌中下调的miRNAs，包括miR-122-5p、miR-148a-3p、miR-192-3p、miR-192-5p、miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-23a-3p（补充图6a），被认为与肥胖和T2D的发展和/或进展有关，17,20,47,48，并且一些在肥胖和T2D患者的循环sEVs/exosomes中减少。49,50,51 此外，许多在T2D iMyos中减少的exosomal miRNAs之前已被报道在急性运动后增加，而急性运动与胰岛素敏感性增加相关，52 包括miR-126-3p、miR-222-3p、miR-30a-3p、miR-339-3p和miR-99a-5p（补充图6b）。T2D iMyos中改变的sEV-miRNAs可能调节远端组织（如脂肪、肝脏和β细胞）的代谢功能。为了验证这一假设，我们用来自健康和T2D iMyos的sEVs处理培养的人类白色脂肪细胞，并进行了葡萄糖摄取和线粒体功能测试。有趣的是，我们发现虽然用健康供体iMyos的sEVs处理增强了受体脂肪的葡萄糖摄取和线粒体呼吸，但用T2D iMyos供体的sEVs处理则减弱了受体脂肪的葡萄糖摄取并降低了线粒体呼吸（图4I, j），表明T2D来源的sEVs及其miRNAs可以调节受体细胞的代谢功能。

在T2D中失调的sEV-miRNAs中富集的核苷酸基序的鉴定 miRNA在exosomes/sEVs中的分泌是一个高度调控的过程，不同细胞类型之间存在差异。53,54,55 在sEVs中miRNAs的分泌也被证明受到胰岛素的调节，至少在脂肪组织和肌肉中是如此。46,56 为了评估T2D iMyos中miRNA分泌模式的潜在差异，我们进行了富集分析，比较了分泌的miRNAs与其细胞内容物的水平。使用一个阈值，即sEVs中的浓度是细胞中的4倍高（表示优先分泌），或者相反（表示优先保留），我们发现23%的miRNAs在sEVs中富集而在细胞中富集，其中118个miRNAs在sEVs中富集，371个miRNAs在细胞中富集（图5a–c）。同样，在T2D iMyos中，176个miRNAs在sEVs中富集，339个miRNAs在细胞中富集（图5b）。这种富集差异伴随着sEVs中miRNAs总体丰度的适度减少，而细胞中富集的miRNAs的总体丰度保持不变（图5d）。

在先前的研究中，46,54 以及其他研究者57,58,59 已经表明，miRNAs在sEVs中的装载和分泌不是一个随机过程，而是受到多种因素的高度调控，包括miRNAs的修饰、miRNAs与RNA结合蛋白的相互作用以及参与exosome生物发生的因素。对对照组和T2D iMyos中选择性分泌或保留的miRNAs的分析揭示了五个与sEVs中miRNAs分泌增加相关的基序和七个与细胞内保留增加相关的基序，假发现率（FDR）< 0.1（补充图7a）。所有前者都是AU富集的，并且在T2D中分泌增加的miRNAs中过度表达。最富集的AU基序是UAUAAA（有一些简并性），在T2D中分泌增加的miRNAs中占64.3%，而在对照组中占31.6%，显示出约2倍的富集（FDR = 0.001）。另一个AU富集的基序（FDR = 0.001）是AUAAU（有一些简并性），在T2D中分泌增加的miRNAs中占41.2%，而在对照组中仅占15.4%。相比之下，有七个基序被鉴定为在T2D中细胞内保留增加的miRNAs中富集（补充图7a）。这些基序的长度从5到8个核苷酸不等，且都富含G + C或A + C。在T2D中保留的miRNAs中最富集的基序是AGUGCAC，在保留的miRNAs中占22%，而在背景miRNAs中占6.1%。另一个富含G + C的基序是GCUGCGU（有一些简并性），在T2D中保留的miRNAs中占12.5%，而在对照组中占2.3%。

对预测的sEV富集miRNAs（基序1-5）靶标的通路分析显示，包括MAPK信号通路、PI3K–AKT信号通路、受体酪氨酸激酶通路、神经营养因子通路和生长因子受体介导的级联反应在内的相互关联的信号通路显著过表达（补充图7b）。此外，与膜转运、RAB GTP酶交换因子、网格蛋白介导的内吞作用和翻译后蛋白质修饰相关的通路也显著富集。因此，这些共享共同序列基序的miRNAs可能共同靶向信号转导和囊泡相关通路。虽然调控miRNAs用于分泌或保留的具体机制需要进一步研究，但对T2D和对照iMyos进行的质量谱和磷酸蛋白组学分析5揭示了几种可能参与这一过程的RNA结合蛋白（RBPs），其磷酸化和/或表达在T2D中发生了变化（图6和表2）。实际上，我们观察到T2D中的iMyos中HNRNPA0、HNRNPA3和RBM3的表达水平发生了显著变化，对对照和T2D iMyos的磷酸蛋白组学数据的分析5识别了几种在T2D iMyos中磷酸化发生了变化的RBPs（表2）。后者包括hnRNPA1，这是一种已知能与AU富集基序（UAAUU）结合的RBP，在T2D中其Ser4和Ser6的磷酸化减少（p = 0.00558）；KHSRP，在T2D中其Ser181的磷酸化减少（p = 0.0386）；以及PUM2，在T2D中其Ser136的磷酸化减少（p = 0.0169）。其他在T2D中磷酸化减少的RBPs见表2。最后，对磷酸蛋白组学数据的重新分析5揭示了胰岛素对RBPs磷酸化的影响。因此，T2D iMyos中RBMX在S149处的磷酸化减少，HNRNPA1在S4处，PUM2在S136处，而HNRNPAB在S241和HNRNPU在S59处的磷酸化在基础条件和胰岛素刺激下均增加（图6a, b和表2）。因此，T2D中miRNAs分泌的改变可能受到参与sEVs中miRNAs分选的RBPs的表达和磷酸化改变的影响。

图6 全尺寸图像

磷酸蛋白组学揭示了T2D iMyos中RBPs的失调。a, b 对照组和T2D组中RBMX2、HNRNP、PUM2、HNRNPAB和HNRNPU的磷酸位点定量。数据以磷酸位点强度值的平均值±SEM表示（×10^5）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，基础状态与胰岛素状态，双因素ANOVA。原始数据见我们的先前研究。

讨论

肌肉是T2D发病机制中的第一个胰岛素抵抗部位。1,2 我们之前已经表明，来自T2D患者以及胰岛素抵抗但无糖尿病患者的iPS细胞（iMyos）衍生的肌母细胞在体外表现出胰岛素信号传导、胰岛素刺激的葡萄糖摄取、线粒体功能和蛋白质表达的缺陷。5,6 虽然肥胖和T2D个体的原代肌管培养也显示出类似的改变，60,61,62,63 但iMyos经过基因重编程为iPS细胞，然后重新分化为肌肉，这些过程伴随着大多数表观遗传标记的丢失，如DNA甲基化和组蛋白甲基化所产生的标记。8,64,65 miRNA表达的差异也可以作为表观遗传调节因子，既调节肌母细胞本身，也通过miRNA分泌调节其他细胞。在本研究中，我们探讨了T2D患者的iMyos中miRNA的表达和分泌是如何改变的。使用一种能够测量超过2,000个人类miRNAs的敏感核酸酶保护测定法，45,66 我们在细胞水平上发现了71个miRNAs的显著变化，其中22个在T2D iMyos中上调，49个下调。虽然已知T2D和其他胰岛素抵抗状态与肌肉和其他组织中的细胞miRNAs的变化有关，20,43,46,67,68,69,70 但据我们所知，这是首次探索这些变化是否可以在体外持续存在。事实上，miR-206和miR-133在T2D iMyos中显著减少，已知它们是胰岛素抵抗和葡萄糖代谢的调节因子11,70 并且据报道在T2D或胰岛素抵抗个体的骨骼肌中下调13,70，这表明它们不仅反映了疾病的影响，也是细胞内在的改变。同样，我们还在iMyos中发现了miR-194-5p的显著减少和miR-135a-5p水平的增加，类似的改变也在胰岛素抵抗的啮齿动物和人类T2D或糖尿病前期的骨骼肌中观察到。17,18,21

对T2D iMyos中下调的miRNAs的荟萃分析揭示了许多与胰岛素抵抗或代谢失调相关的miRNAs。例如，miR-133a和miR-210-3p可以靶向FGFR1、SRF、BDNF、ChREBP和GLUT4，从而改变胰岛素敏感性和葡萄糖摄取。13,32 同样，miR-29b-3p可以通过靶向GLUT4和HK2参与胰岛素刺激的葡萄糖代谢和脂质氧化的调节，以及细胞外基质和纤维化（靶向COL4A5和LAMA2）、炎症/NF-κB相关信号（靶向REL）和脂质代谢（靶向HMGCR）；miR-200c-3p靶向参与细胞身份/应激信号调节（ZEB1）、炎症信号（IKBKB）和翻译/mTOR相关调控（RPS6KB1）的基因，所有这些通路在胰岛素抵抗的肌肉中都发生了改变。23,24,25,29,30,31,71 此外，miR-138-5p靶向SIRT1并促进TNFα诱导的胰岛素抵抗，28 而SOX4调节β细胞功能。27 我们研究中的一个意外发现是，包括miR-5004-3p、miR-196a-3p、miR-335-5p和miR-23a-5p在内的几种miRNAs表现出性别依赖性的表达模式，特别是在T2D背景下。其他生物学背景下也报告了miRNA表达的性别差异，这可能有助于解释疾病易感性的性别差异或疾病发病机制。72,73,74,75,76 在iMyos中，参与胰岛素信号通路的调节的miRNAs，如miR-29b-1-5p、miR-138-5p、miR-155-5p和miR-335-5p，在T2D男性中减少，而在T2D女性中不变。这些miRNAs已被证明靶向胰岛素信号通路的关键组分，包括胰岛素受体、IRS蛋白、PI3K调节亚单位、PTEN和PPARγ。23,72,77 需要进一步的研究来确认这些差异，以及这些性别特异性miRNA变化的任何功能后果。

尽管大多数差异表达的miRNAs是作为独立的转录单位编码的，但在T2D iMyos中减少的一组miRNAs在染色体7和9上形成了簇。值得注意的是，七个下调的miRNAs映射到染色体7上的两个不同簇。簇1位于染色体7q32.3，编码miR-29a-5p、miR-29a-3p、miR-29b-1-5p和miR-29b-3p。染色体7q32.2上的簇2产生miR-182、miR-96和miR-183。所有这七个miRNAs在T2D iMyos中都下调，表明它们的协调抑制可能涉及染色体水平或表观遗传机制。在染色体9q22.32，有一个簇产生miRNAs，包括let-7a-5p、let-7f-5p和let-7d-5p，所有这些在T2D中都下调，再次表明可能存在转录或表观遗传调控，可能导致胰岛素抵抗肌肉的代谢和炎症信号特征的破坏。相比之下，染色体7和9上的其他miRNAs，如miR-7-1-3p、miR-455-5p和miR-876-3p，来自不同的基因位点，因此可能受到独立的调控。除了细胞水平上的变化外，我们的研究还揭示了T2D iMyos中分泌到sEVs中的miRNAs有更大的差异，其中70个sEV分泌的miRNAs上调，接近300个下调。这种情况并不是由于DICER或DGCR8在mRNA或蛋白质水平上的任何一般性改变，而是由于miRNA分选和/或分泌的变化。多项研究报告了肥胖和2型糖尿病（T2D）患者循环中的外泌体（svESs）/外泌体miRNAs发生的变化，并指出这种失调可能对肥胖/糖尿病的病理生理机制有所贡献。43,67,68 对T2D svESs中上调的miRNAs的目标基因进行通路富集分析后发现，这些miRNAs可能作用于远端组织的多种代谢过程，包括脂肪酸代谢和信号转导。与此一致，我们发现用来自正常肌肉细胞的svESs处理受体脂肪细胞可以增强葡萄糖摄取和线粒体代谢，而用来自T2D肌肉细胞的svESs处理则会导致受体脂肪细胞中的胰岛素刺激的葡萄糖摄取减少和线粒体功能受损，这支持了svESs对受体细胞具有直接功能性效应的观点。45 相反，对T2D中svES分泌减少的miRNAs所靶向的基因进行通路分析后发现，最富集的目标通路与化学突触传递和膜运输途径相关。尽管还需要进一步的研究，但这种svES-miRNAs的通路富集分析支持了svES介导的miRNA转移可能协调一系列效应的观点，这些效应整合并放大了这些miRNAs在远端组织（如脂肪细胞）中的代谢和功能作用。

miRNAs通过两种主要机制在蛋白质水平上改变其靶标：1）增强靶标mRNA的降解；2）干扰靶标mRNA的翻译。有趣的是，当我们检查T2D中上调的miRNAs的靶标基因的mRNA水平时，发现绝大多数靶标在蛋白质水平而非mRNA水平上受到调控。因此，在T2D肌肉细胞中，127个上调的miRNAs的靶标在蛋白质水平上显著减少，而49个下调的miRNAs的靶标中有190个在蛋白质水平上增加，但只有两个在mRNA水平上也发生了改变。这一显著发现表明，T2D相关的miRNA表达变化主要是通过调控翻译而不是促进mRNA降解或分解来影响其靶标的蛋白质水平。事实上，这一点可以通过将miRNAs转染到正常肌肉细胞中得到验证。例如，将T2D中增加的miR-7161-3p和miR-1272以及减少的miR-222-5p和30b-3p转染到正常肌肉细胞后，确实改变了它们的多个靶基因（包括METTL14、PIK3CA、FOXO1、ERK1/2和p38 MAPK）的蛋白质水平，但在大多数情况下，mRNA水平没有变化。这一发现与翻译效率和/或蛋白质稳定性水平的调控机制一致，这些机制已知受到miRNAs和RNA结合蛋白的调控。我们的荧光素酶报告基因实验也表明miR-1272靶向METTL14和PIK3CA mRNA的3’UTR，并在转录后调控这些基因。有趣的是，在T2D肌肉细胞中表达改变的miRNAs与从这些细胞分泌的svESs中改变或富集的miRNAs之间仅有非常有限的重叠，这表明miRNA的移出并不简单地是细胞内变化的镜像。这与我们和其他研究的结果一致，表明分泌过程涉及选择性miRNA的分选，46,54,58,81,82 即一些miRNAs优先保留在细胞内以调节细胞内通路，而另一些则优先包装到svESs中用于分泌，在细胞间通信中发挥作用。导致miRNAs优先释放或保留的机制包括miRNAs内部的序列基序及其与RNA结合蛋白和AGO的相互作用。54,58,82,83,84 在T2D的背景下，这一机制也可能影响miRNAs的重新分布，从而可能改变细胞内平衡和向受体组织的信号传递。例如，已有研究表明hnRNPA1的磷酸化改变会影响脂肪细胞和肌肉细胞在胰岛素刺激下的miRNA保留与分泌。46,54 多种RNA结合蛋白（包括hnRNP家族成员）已知调节miRNA的生成和功能。例如，hnRNPA1通过结合pri-miR-18a的末端环（靠近茎-环结构的3′端）来增强Drosha剪接并调节pri-let-7a-1的加工。85,86,87 通过表达的动态变化、翻译后的修饰以及亚细胞定位（特别是在胰岛素刺激下或T2D状态下），这些RNA结合蛋白以组合方式控制miRNAs的选择性保留或分泌，从而微调细胞间通信和代谢适应。

我们的研究将这一框架扩展到人类肌肉细胞，表明与T2D相关的信号变化可能会影响RBP的活性，进而影响细胞内的miRNA运输，导致T2D患者svESs中miRNA分泌的失调。总之，利用iPS衍生的肌母细胞模拟人类肌肉，我们发现T2D不仅影响miRNA的表达，还独立影响svESs中的miRNA分泌。这些变化是细胞内在的，并作为肌肉细胞以及可能参与T2D相关病理机制的其他组织（如脂肪细胞、肝脏和β细胞）中蛋白质表达的重要表观遗传调控因子。miRNA、蛋白质表达和细胞功能之间的这种相互作用为这种疾病的发病机制增添了新的维度。虽然我们的研究表明T2D影响miRNA的表达和分泌，并暗示这些变化可能对疾病发病机制有所贡献，但要验证这一点，需要进一步的体内研究来确定这一机制如何与其他导致胰岛素抵抗和T2D的因素相互作用。此外，直接研究磷酸化和其他翻译后修饰如何影响体内模型中的miRNA表达或svES的装载也非常重要。我们也意识到目前缺乏对svES靶标及其下游功能效应的体内验证，同时患者来源的iPS细胞可能保留供体特异性的表观遗传变异，这可能会影响观察到的miRNA和功能表型的个体间差异。未来的工作还应探讨miRNA处理蛋白（如Dicer、AGO2）与RNA结合蛋白之间的相互作用是否会影响T2D中miRNAs在svESs中的选择性排序和改变。通过解决这些问题，以及在体内和体外使用遗传学方法对这些改变的miRNAs进行敲除和过表达的研究，将有助于进一步明确这些变化如何影响T2D的病理生理机制。

**材料与方法**

**研究对象**
所有程序均得到了卡罗林斯卡学院伦理委员会的批准。研究参与者均签署了知情同意书。根据我们之前的研究，从有或无T2D病史的个体中收集了股外侧肌肉样本。5,6,8 活检采用局部麻醉（5 mg/mL盐酸利多卡因）在含青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的冷却PBS中进行。

**纯化svESs的电子显微镜观察**
纯化的svESs以每样本5 μL的量吸附到镀碳的网格上。网格先在1% BSA中封闭10分钟，然后与稀释在1% BSA中的CD63、CD81或CD9的一抗孵育30分钟。对于CD63，使用抗人CD63抗体（BD Pharmingen, 556019；1:20）、CD9抗体（BD Pharmingen, 555370；1:20）和CD81抗体（BD Pharmingen, 555675；1:20）进行孵育，之后用PBS冲洗。随后网格与兔抗鼠桥接抗体（Abcam, ab6709；1:50）孵育20分钟，冲洗后用10-nm蛋白A-金标记20分钟。用PBS和水冲洗后，网格用0.75%乌拉酰甲酸负染色30秒。样本使用JEOL 1200EX透射电子显微镜观察，图像由AMT 2k CCD相机记录。

**miRNA分析**
为了评估细胞和svESs中的miRNAs，我们采用了HTG EdgeSeq技术（HTG Molecular Diagnostics, Inc., Tucson, AZ），这是一种基于下一代测序的miRNA分析平台，利用核酸酶保护机制。45 简而言之，HTG EdgeSeq miRNA全转录组检测（WTA）包含2102个探针，用于检测2083个人类miRNAs。为了筛选低表达的miRNAs，我们保留了在至少4个样本中每百万计数（CPM）大于1.19的miRNAs。然后通过加权 trimmed mean of M-values（TMM）对计数进行标准化。90 标准化因子范围为0.19至21.76。

**统计分析**
统计分析和图表制作使用GraphPad Prism v8软件完成。数据以均值±SEM表示。条形图表示平均值（每组n=8），误差条表示SEM。统计分析采用双尾t检验（?p<0.05，***p<0.01，****p<0.001）。每个图表对应的图例末尾提供了数据的详细描述、使用的统计方法及样本量。