CaMKIIα 在小鼠中介导轮跑活动对昼夜节律起搏器的反馈效应

《Scientific Reports》：CaMKIIα mediates feedback effects of wheel-running activity on the circadian pacemaker in mice

　　摘要：CaMKIIα功能敲除小鼠（K42R）在短光照周期（LD6:18）下的跑步轮（RW）节律同步模式表现出显著变化，但在长光照周期（LD18:6）下则没有变化。在野生型小鼠（WT）中，同步发生在光照关闭阶段，而在大多数K42R小鼠中，同步发生在光照开启阶段。这些差异可以通过昼夜周期（τ）的延长以及K42R小鼠活动开始和结束之间的耦合减弱来很好解释。实际上，在持续黑暗（DD）条件下，K42R和WT的τ分别长于和短于24小时。在没有跑步轮的情况下，WT的τ延长，而K42R的τ缩短。同样，WT的活动时间延长，而K42R的活动时间缩短。重要的是，在没有跑步轮的情况下，两种基因型的τ没有差异，这一点在未处理过的小鼠中也得到了验证。在重新引入跑步轮后，τ和α都恢复到了去除前的水平。这些结果表明，K42R的行为节律变化是由于缺乏由CaMKIIα介导的跑步轮活动反馈效应。一个假设CaMKIIα参与两者耦合的双振子模型成功模拟了K42R中的跑步轮活动效应。

引言：Ca2+/Calmodulin依赖性蛋白激酶IIα（CaMKIIα）是大脑中钙离子（Ca2+）功能的重要组成部分，包括昼夜行为节律。在K42R小鼠中，这种激酶的缺失突变延长了跑步轮活动的昼夜周期（τ），增加了活动时间（α），即活动开始和结束之间的间隔，并在持续黑暗条件下表现出反复的α压缩和α膨胀现象。这些行为表型被解释为昼夜振荡的减弱以及活动开始和结束之间耦合的削弱。另一方面，K42R小鼠对长光照周期（LD12:12）的同步似乎未受到影响。

长和短光照周期的同步可以通过非参数模型来解释，在该模型中，τ、α以及光脉冲的相位响应曲线（PRC）的形状起着关键作用。在夜行性啮齿动物中，长光照周期（如LD18:6）会压缩昼夜行为节律，而短光照周期（如LD6:18）则会使行为节律膨胀。此外，对于τ短于24小时的小鼠，其在光照关闭阶段实现同步，此时的光照信号会导致昼夜节律的相位延迟；而对于τ长于24小时的白化鼠，其在光照开启阶段实现同步，此时的光照信号会使昼夜节律提前。如果非参数同步模型适用于τ长于24小时的K42R的同步现象，那么K42R对LD6:18的同步将与WT显著不同。

已有文献表明，跑步轮活动会对昼夜节律起反馈作用，并缩短夜行性啮齿动物的τ。在主观判断的下午进行跑步轮活动也被发现可以提前行为节律，并有助于重新同步到提前的光照周期。然而，跑步轮活动的反馈机制尚未完全理解。在之前的K42R研究中，行为节律是通过跑步轮活动图来监测的。因此，明确CaMKIIα功能丧失所观察到的效应是否通过跑步轮活动的反馈效应介导是很重要的。在本研究中，我们探讨了K42R在上述光照周期下的同步模式，并在之后将其置于持续黑暗条件下进行观察。行为节律通过跑步轮和被动红外传感器（IR）进行监测，这两种方法分别代表应激和非应激类型的活动图。

结果：K42R小鼠对LD18:6和LD6:18的光照周期的同步模式与野生型小鼠（WT）相比有显著差异（图1，补充图1和2）。然而，K42R对LD6:18的同步模式差异显著。WT的行为节律表现出逐渐（类型a）或立即（类型b）的相位提前，并保持与光照关闭阶段的稳定相位关系，使得活动开始紧随光照关闭阶段之后（图1A）。类型a和类型b小鼠的比例为5:3。在LD6:18结束时，平均α为12.52±0.71小时（平均值±标准差，n=8），随后在持续黑暗条件下的平均τ为23.69±0.18小时（n=8）。

相比之下，大多数K42R小鼠无法对LD6:18建立稳定的同步模式，表现出四种不同的类型（图1B，补充图2）。在类型c中，活动开始逐渐提前以接近光照关闭阶段，而活动结束在最初几周内没有相位变化，随后当活动开始出现相位延迟时才开始相位延迟。三种K42R表现出这种同步模式，它们在LD6:18结束时的平均α为15.81±1.24小时（n=3），随后在持续黑暗条件下的τ为24.16±0.11小时。在类型d中，活动开始在最初几天内逐渐提前，但随后出现相位延迟。相反，活动结束在释放到LD6:18后立即出现相位延迟。四种K42R表现出这种同步模式，它们在LD6:18结束时的平均α为14.28±0.91小时（n=4），随后在持续黑暗条件下的τ为24.18±0.06小时（n=4）。在类型e中，活动开始立即提前，并在整个LD6:18期间保持与光照关闭阶段的稳定相位关系，而活动结束从LD6:18开始就出现相位延迟。两种K42R表现出这种同步模式，它们在LD6:18结束时的α分别为17.93小时和13.79小时，随后在持续黑暗条件下的τ分别为24.01小时和24.08小时。两种K42R的同步模式与WT相似（类型f），它们的α分别为13.79小时和15.45小时，τ分别为23.93小时和23.78小时。所有K42R的平均α为15.05±1.46小时（n=11），显著长于WT的平均α（12.52±0.71小时，n=8，p=0.0003）。K42R随后在持续黑暗条件下的平均τ也显著长于WT（24.10±0.15小时，n=11 vs WT的23.69±0.18小时，n=8，p=0.0006）。

跑步轮去除对IR节律昼夜周期的影响：由于三种K42R小鼠在去除跑步轮后表现出反复的α压缩和膨胀现象，因此未将其行为节律纳入分析。跑步轮去除对K42R昼夜行为节律的影响与WT完全相反（图2，补充图3和4）。由于同一个体在前两次实验中活动开始和结束的τ没有显著差异，因此后续分析使用了活动开始的τ。WT的τ从23.69±0.18小时显著延长至24.02±0.09小时（n=8，p=0.0023），而K42R的τ显著缩短至24.17±0.08小时至24.05±0.08小时（n=8，p=0.0019）。在WT中重新引入跑步轮后，τ显著缩短至23.80±0.10小时（n=8，p=0.0012）；而在K42R中显著延长至24.29±0.16小时（n=8，p=0.0010；图2B）。跑步轮去除对WT和K42R的α产生了相反的影响（图2C）。在WT中，去除跑步轮显著延长了α，从14.22±1.75小时延长至15.55±1.43小时（n=8，p=0.0119）；而在K42R中，去除跑步轮显著缩短了α，从15.55±0.87小时缩短至14.17±0.99小时（n=8，p=0.0125），重新引入跑步轮后α显著延长至15.55±0.79小时（n=8，p=0.0041）。无跑步轮时K42R的α显著短于WT（p=0.0416）。

在持续黑暗条件下，未处理过的WT和K42R的IR行为节律被监测（图3A）。WT的平均τ为23.81±0.08小时（n=9），K42R的平均τ为23.76±0.12小时（n=8），两者之间没有显著差异（p=0.3293）（图3B）。两种基因型的平均α也没有显著差异（WT：13.20±0.94小时，K42R：12.67±0.74小时；p=0.2200）（图3C）。RW活动被认为会对昼夜节律系统产生反馈作用（即内在周期τ_E和τ_M，以及耦合强度C_EM和C_ME）。对τ_E和C_EM的影响是通过CaMKIIα依赖的机制介导的，而对τ_M和C_ME的影响则是通过非CaMKIIα依赖的机制介导的。（B-D）模型中的振荡器在前10天被调整为LD18:6光照周期，接下来10天调整为LD6:18光照周期，然后暴露在持续黑暗条件下（C、D）。在第30到40天之间，没有施加RW。E振荡器和M振荡器的峰值相位分别用红色和蓝色表示。（E）有RW和无RW时的自由运行周期，以及再次有RW时的周期。（F）有RW和无RW时的活动时间，以及再次有RW时的活动时间。** P<0.01；采用重复测量双因素方差分析，并进行事后Tukey-Kramer检验。

在有和没有RW的情况下，模拟节律的活跃起始和结束时间显示出：在野生型（WT）中，昼夜周期稳定时短于24小时；而在K42R中，昼夜周期则长于24小时，这与实际实验观察结果一致（见图2）。RW的移除和重新引入在两种基因型中都使得模拟节律的昼夜周期朝相反方向改变，如图4E所示。这与实际实验结果完全相同（见图2B）。RW的移除对活跃时间的影响在WT和K42R中也是相反的（见图4F），这与实际实验结果一致（见图2C）。重要的是，在模拟中，WT和K42R在没有RW的情况下昼夜周期没有差异（见图4），这与天真的小鼠观察结果一致（见图3）。

讨论：
K42R在LD6:18光照周期和持续黑暗条件下显示出独特的昼夜行为节律，通过RW活动图观察得到。这些特征包括：（i）系统昼夜周期延长（τ_sys）；（ii）α振荡期的延长；（iii）随着RW活动减弱而出现的α振荡期的反复压缩和扩张；（iv）对LD6:18光照周期的同步性不稳定；（v）与WT相比，τ和α对RW移除和重新引入的反应相反。所有这些特征都可以用E和M振荡器模型来很好地解释，该模型用于模拟活跃起始和结束的过程。RW活动增强了E和M振荡器及其之间的双向耦合。RW活动对E振荡器的影响以及E振荡器对M振荡器的耦合是通过涉及CaMKIIα的机制介导的。

**对LD18:6和LD6:18光照周期的同步化**：光照周期的同步化是通过非参数同步化模型来解释的，其中E和M振荡器参与其中。E振荡器受到主观傍晚时分的光信号的同步化，这会延迟振荡器的相位；相比之下，M振荡器受到主观清晨时分的光信号的同步化，这会提前振荡器的相位。E和M振荡器对光脉冲的响应在脉冲响应曲线（PRC）上有所不同。行为节律对LD6:18光照周期的同步化取决于τ_sys，这由E和M振荡器共同整合。LD18:6光照周期的同步化是通过活跃起始的即时相位延迟和活跃结束的相位提前来实现的，导致了极端的α振荡期压缩（见图1）。每天两次相位调整保证了昼夜节律系统的稳定同步化。然而，如果考虑到PRC中延迟和提前的小幅度变化，仅靠光对小鼠的PRC反应不足以完全解释这种即时相位调整。因此，LD18:6光照周期的同步化可能是由光信号掩盖效应和/或光对E和M振荡器之间耦合的修改共同作用的结果。

**对LD6:18光照周期的同步化**与LD18:6光照周期的同步化不同，后者不是通过两次相位调整实现的，而是因为长时间处于黑暗状态。WT的同步化是通过E振荡器的相位延迟来实现的，这使得活跃起始发生在光照关闭阶段附近；而由于没有同步化的光信号作用于M振荡器的光敏感部分，活跃结束的相位则由E和M振荡器之间的耦合强度决定。K42R的同步化则是通过一次相位调整实现的。相比之下，K42R的同步化变化很大，可以分为四种类型，这取决于τ_sys和耦合强度。在K42R中，α振荡期明显长于WT，表明E和M振荡器之间的耦合变弱了。表现出Type c和Type d类型同步化的 mice具有更长的τ_sys和更宽的α振荡期。活跃起始的初始相位提前是α振荡期压缩的过程。Type d类型中活跃结束的相位延迟也是由于α振荡期压缩造成的。当活跃结束与E振荡器达到稳定的相位关系后，活跃起始开始相位延迟，显示出类似于在骨架光照周期下观察到的波动现象。我们对这种独特现象的解释是：当α振荡期压缩停止并且E和M振荡器之间建立起稳定的相位关系时，行为节律的自由运行周期超过了24小时。在Type c类型中，CEM比CME强得多；而在Type d类型中则相反。Type e类型中的相互耦合非常弱，E和M振荡器分别同步于光照关闭和光照开启阶段。

在某些动物中，相位提前的变化看起来是瞬间的，这可能是由于光信号去除了负面的掩盖效应。已知RW活动会加速活跃起始的相位提前。已知在主观傍晚时分施加RW活动脉冲可以提前进行中的行为节律，但在主观清晨时分则不会。RW引起的相位提前机制尚不清楚。重新同步化的过渡期可能是E振荡器与活跃起始之间的暂时分离。RW活动可能有助于它们之间的同步。在这种RW效应中，CaMKIIα可能不参与其中，因为在这种效应中，WT和K42R都观察到了即时的相位调整。

**RW活动对昼夜节律系统的反馈效应**：本研究最有趣和最重要的发现是RW活动对K42R中τ_sys和α的相反影响。移除RW会使WT中的τ和α延长，而在K42R中则会缩短它们。换句话说，RW活动在WT中缩短了τ和α，但在K42R中延长了它们。在E和M振荡器模型中，τ_sys是τ_E、τ_M以及C_EM和C_ME的函数。τ_sys的缩短可以通过加速E振荡器来进一步缩短τ_E，或者通过增强CEM来增加E振荡器对τ_sys的影响来实现。另一种可能是通过抑制M振荡器来缩短τ_M，或者通过减弱CME来使CME相对较强。然而，前一种可能性更大，因为观察到τ_sys与RW活动分布之间存在有趣的关联性。例如，阉割会延长τ并导致雄性小鼠的活动起始不明确；而睾酮替代则会缩短τ并产生明确的活跃起始。在K42R中，当τ_sys增加时，活跃结束时的RW活动变得更加明显。这些发现表明，RW活动在活跃起始时的作用会影响E振荡器，从而缩短τ_sys。RW活动的影响被称为非光性时间线索，它们对昼夜节律系统的影响与光脉冲的作用相反。这种非光性同步化也可以用RW活动对E振荡器的影响来解释，很可能影响E振荡器的神经耦合。有证据表明，SCN中的区域性起搏器由多个细胞振荡器组成。

**CaMKIIα在RW活动反馈效应中的作用**：先前的研究表明，CaMKII可能介导光照引起的昼夜行为节律的相位延迟。CaMKII的化学抑制剂可以减弱光引起的相位延迟。光信号通过谷氨酸分泌刺激SCN神经元，激活NMDA受体，随后通过Ca离子内流激活CaMKII。CaMKII随后磷酸化CREB，诱导时钟基因Pers的转录，从而导致昼夜节律起搏器的相位调整。然而，这种机制既不能解释对长和短光照周期的同步化，也不能解释在没有功能性CaMKIIα的小鼠中RW活动的反馈效应。K42R的行为节律在LD12:12和LD18:6光照周期下与WT相似，对光信号的反应需要同时包含相位延迟和相位提前。当前的结果表明，RW活动对E振荡器和CEM的反馈效应是通过CaMKIIα依赖的机制介导的。在没有功能性CaMKIIα的情况下，RW活动无法缩短τ并维持活跃起始和结束之间的稳定相位关系（见本文中的图2）。重要的是，当通过红外（IR）监测行为节律时，功能性CaMKIIα的缺失并没有影响这些昼夜参数。这一结果在从未用于其他实验的天真WT和K42R中也得到了验证。两种基因型之间的τ和α没有显著差异。因此，CaMKIIα对于RW活动激活E振荡器或增强CEM是必要的。然而，CaMKIIα的缺失会使τ超过IR活动节律的水平，表明RW活动还增强了M振荡器和/或CME，而这些不受CaMKIIα功能障碍的影响。认为RW活动通过不同于E振荡器及其与M振荡器耦合的机制来刺激M振荡器及其与E振荡器的耦合。这种解释基于表型观察，需要进一步的研究来验证其准确性。

在之前的研究中，培养的SCN切片中PER2::LUC节律的τ在K42R中显著长于WT。这些发现与当前的行为结果不一致。这种差异的原因尚不清楚。SCN培养中的昼夜PER2::LUC可能并不直接反映IR活动节律。有报道称SCN的腹侧和背侧区域以及SCN的头部和尾部区域存在区域性昼夜起搏器。之前认为E和M振荡器位于SCN的两侧之一，但行为和同步化实验表明SCN的双侧具有功能冗余。有证据表明，SCN中的抗利尿激素（AVP）神经网络在区域振荡器之间的耦合中起关键作用。此外，有证据表明AVP介导的耦合是双向的但不对称的。据推测，CaMKII在下丘脑的室旁核中参与AVP的产生。可以假设RW活动刺激了参与E振荡器形成和从E到M振荡器信号传递的AVP网络。目前的发现都来自雄性小鼠，因为活动存在性别依赖性差异。已知雌性小鼠的昼夜活动节律显示出与其发情周期平行的周期性变化。可能需要包括雌性小鼠在内的进一步研究来推广这些发现。

**K42R小鼠昼夜节律的数学模型**：本研究最重要的发现是RW活动对昼夜节律起搏器的反馈效应，这种效应是通过CaMKIIα依赖的机制介导的。在我们的模型中，假设RW活动会影响WT中E和M振荡器的功能，并进一步假设CaMKIIα依赖的机制影响E振荡器而不是M振荡器（见图4）。这些假设基于以下发现：两个振荡器之间的耦合是双向的，并且受到实验操作的不同影响。该模型成功模拟了RW移除对K42R中E振荡器功能（如τ_E和C_EM）的增强作用，而对M振荡器功能的影响则没有。该模型还模拟了动物对长和短光照周期的同步化。在K42R中检测到了LD6:18中的四种节律同步模式；其中两种（类型c和d），即最常见的类型（7/11），可以通过模型进行满意地模拟，但另一种（类型e），较为少见的类型（2/11），则无法被模拟。我们需要进一步研究来模拟类型e的节律同步，例如通过改进PRC的形状。在当前模型中，PRC在进动和延迟部分被设置为对称的，并且WT和K42R的PRC形状相同。对于大多数啮齿动物来说，进动和延迟部分是不对称的，并且与系统τ5,15相关。

**结论**
K42R在通过RW活动图测量昼夜行为节律时表现出多种表型。这些节律可以通过缺乏对E振荡器的反馈效应以及从E振荡器到M振荡器的耦合来解释。

**材料与方法**
**动物实验**
动物实验按照北海道大学《实验动物照料与使用指南》进行。本实验已获得北海道大学动物研究委员会的批准（许可编号：16–0073）。通过引入将第42个赖氨酸替换为精氨酸的点突变，创建了C57BL/6J背景的CaMKIIα敲入小鼠（K42R）。使用杂合子K42R进行繁殖以获得纯合子K42R及其同窝WT。本研究中使用的所有WT都是同窝WT，它们与K42R来自同一窝。动物在LD12:12条件下饲养，光照时间为每天06:00开始，18:00结束。光照阶段的照明强度约为100 lx（荧光灯）。室温为22±2 °C，湿度为60±10%。动物随时可以获取Chow（Oriental Yeast Co., Tokyo, Japan）饲料和自来水。断奶在出生后第21天进行。本实验使用了纯合子K42R及其同窝WT雄性小鼠。

**行为活动测量与数据分析**
当小鼠两个月大时，将它们转移到装有跑步轮（RW，直径10厘米）的单独笼子中，该容器位于一个光线密封的盒子内，光照阶段的光照强度约为300 lx，黑暗阶段的光照强度小于0.01 lx。光照强度由TOPCON/IM-5（东京）光度计测量，测量范围为0.001–1,999,000 lx。在完全黑暗（DD）条件下，通过红外LED灯（850 nm）进行动物护理（如向喂食盒补充食物颗粒、补充饮用水和更换笼子）。每7–10天对这些动物照射一次红外光，每次照射时间少于1分钟。我们监测了两种不同的行为：一般运动和RW活动（详见其他文献13）。具体来说，一般运动是通过安装在记录盒天花板上的被动红外（IR）传感器（KPS-3227, ELEKIT）来测量的。传感器与笼子底部的距离为29厘米。传感器检测到由动物运动产生的热辐射（红外波）的变化。检测的时间分辨率为4秒。IR传感器不会对诸如站立或啃咬等微小动作作出反应。同时，记录跑步轮的转动次数（完整转动）。IR和RW活动每分钟使用PC系统（Stanford Chronobiology kit, Stanford Software Systems, CA, USA）进行记录，并通过Clock Lab（Actimetrics, IL, USA）进行分析。活动数据以6分钟为时间间隔进行分析。在稳态自由跑步条件下，分别测量行为节律的起始和结束时间（τ）。通过在双轴 actogram 中视觉定义每个周期的活动起始和结束时间，然后使用Clock Lab软件为至少20个连续的活动起始或结束时间点绘制回归线。用于计算τ的线是基于活动起始时间绘制的。活动起始和结束时间之间的间隔定义为α，即活动带的长度。一名研究人员进行了测量，另一名研究人员独立重复了分析。尽管绝对值存在轻微差异（τ为0.02±0.11小时，α为0.48±1.42小时，n=48），但两位研究人员都确认了有无RW以及WT和K42R之间的τ和α存在显著差异。

**实验程序**
**实验1. 使动物适应LD18:6和LD6:18**
使用两个月大的雄性小鼠（11只K42R和8只同窝WT）。在LD12:12条件下，通过RW和IR监测它们的行为节律3周。然后通过将光照关闭阶段延迟3小时并将随后的光照开始阶段提前3小时，使动物适应LD18:6。因此，黑暗或光照阶段的中点在本地时间上保持不变。30天或37天后，通过将光照关闭阶段提前6小时并将随后的光照开始阶段延迟6小时，使动物适应LD6:18，同样保持黑暗或光照阶段的中点不变。再次30天或37天后，将这些动物放入DD环境中饲养6周，延长LD6:18的最后黑暗期。

**实验2. 去除RW对τ的影响**
在动物适应LD6:18后，将它们放入DD环境中饲养14周，以研究去除RW对τ的影响。在放入DD环境后的第6周，移除笼子中的RW。在此期间，通过IR测量行为节律。随后，在笼子中重新引入RW，再饲养4周。分别计算这三个阶段（有RW、无RW和重新有RW）中的活动起始和结束时间的τ。测量每个阶段的最后20个周期的数据。

**实验3. 无RW经验的K42R和WT在DD中的τ**
八只K42R和九只WT在LD12:12条件下饲养，它们无法接触RW，也从未用于任何实验。通过IR监测它们的行为节律。然后将它们放入DD环境中，并使用Chi-square周期图39（基于在DD环境下稳态自由跑步40天的数据）确定τ。

**实验4. 数学模拟**
基于两个相互耦合的相位振荡器模型14，对实验1和2进行了数学模拟。根据Pittendrigh（1981）的划分，驱动活动开始的振荡器称为傍晚（E）振荡器，驱动活动结束的振荡器称为早晨（M）振荡器。我们假设E振荡器的固有周期（τ_E）小于24小时，而M振荡器的固有周期（τ_M）大于24小时（如先前研究所提出的）。两个振荡器之间的耦合是双向且不对称的。假设从E振荡器到M振荡器的耦合（C_EM）比相反方向的耦合（C_ME）更强（40）。

**统计分析**
统计分析使用Excel Tokei 2012（SSRI, 日本）进行。基因型之间的差异通过t检验进行分析，不同阶段之间的差异通过重复测量双向ANOVA及后续的Tukey–Kramer检验进行评估。