利用高效液相色谱法结合二极管阵列检测技术，测定七种膳食补充剂基质中的总辅酶Q10含量

《Journal of Chromatography A》：Determination of total coenzyme Q 10 in seven types of dietary supplement matrices by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection

　　

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  针对七种不同基质的标准化HPLC-DAD方法用于测定总CoQ₁₀含量。
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  针对软糖的特殊提取方法解决了基质与溶剂之间的兼容性问题。
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  预先氧化FeCl₃可以将CoQ₁₀H₂转化为稳定的CoQ₁₀。
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  该方法表现出高选择性、常规质量控制的稳健性和精确度。
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  在六个实验室进行的验证证明了该方法的操作性能。

引言

辅酶Q₁₀（CoQ₁₀），也称为泛醌，是一种脂溶性化合物，主要存在于线粒体中，在电子传递链中充当电子载体[1,2]。它通过促进三磷酸腺苷（ATP）的合成，在细胞能量产生中起着关键作用。除了在能量代谢中的作用外，CoQ₁₀还作为一种亲脂性抗氧化剂，与其他抗氧化剂协同作用，保护循环中的脂蛋白免受氧化损伤[3]。CoQ₁₀还参与免疫调节，通过增强巨噬细胞和自然杀伤细胞的活性以及调节肠道微生物群[4]。在人体内，CoQ₁₀的水平通过内源性生物合成和饮食摄入来维持。然而，这种生物合成能力会随年龄增长而下降，并可能因营养不良、压力和感染等因素进一步受损[5]。由于CoQ₁₀的重要生理作用，人们对其补充剂越来越感兴趣，尤其是在老年人和心血管疾病患者中。临床试验支持了补充剂的安全性，确立了每人每天最多1.2克的摄入安全剂量[6]。为了满足这一需求，市场上有多种CoQ₁₀膳食补充剂，浓度范围广泛（通常每份从20毫克到200毫克不等）。这些商业产品有多种形式，如片剂、硬胶囊和软胶囊、颗粒、粉末和软糖。因此，准确量化CoQ₁₀对于常规质量控制（QC）至关重要。这需要一种能够适应广泛浓度范围和处理多种基质组成的实际分析方法。

在生物和食品基质中测定CoQ₁₀通常采用高效液相色谱（HPLC）结合多种检测器，如二极管阵列（DAD）[7]、电化学检测[8]和质谱[9,10]。这些分析一般首先使用各种溶剂（例如甲醇、乙醇、正己烷、异丙醇或其混合物）进行提取[11, [12], [13]，然后再进行仪器分析。其他提取技术包括超临界流体萃取[14]、加速溶剂萃取[15]和皂化萃取[16]。其中，直接溶剂萃取被广泛认为是最简单和最有效的方法，特别适合常规分析。然而，关于膳食补充剂中CoQ₁₀分析的现有文献缺乏涵盖所有现代剂型的简化工作流程。先前的研究主要集中在传统形式的补充剂上，如片剂、软胶囊和硬胶囊[17], [18], [19]。这些研究通常使用异丙醇或异丙醇/水混合物进行提取，但没有解决消除复杂基质干扰的具体技术挑战。例如，软胶囊通常含有大量的油性基质成分，如植物油，这会导致色谱基线干扰或共洗脱问题。相比之下，在软糖中准确测定CoQ₁₀存在基质与溶剂之间的不兼容性。CoQ₁₀高度溶于脂肪，需要亲脂性有机溶剂进行有效提取，而水溶性的软糖凝胶基质（由明胶、果胶或琼脂组成）完全不溶于这些溶剂。这种溶解度的差异使得直接提取变得复杂，导致分析物回收不完全和严重的乳化现象，针对这种特定形式的经过验证的实际定量方法仍然有限。

另一个关键且未解决的问题是成品中CoQ₁₀的氧化还原状态。补充剂可能含有氧化形式（泛醌，CoQ₁₀）、还原形式（泛醇，CoQ₁₀H₂）或两者的混合物。虽然大多数产品含有更稳定的CoQ₁₀形式，但一些制造商有意将产品配方调整为仅含CoQ₁₀H₂或与CoQ₁₀结合使用，以增强生物活性。此外，制造过程也可能无意中改变CoQ₁₀的氧化还原状态。例如，在软胶囊中与脂溶性还原剂（如维生素E）共包装，或在硬胶囊中与维生素C和乳化剂共包装，可能会在生产过程中使CoQ₁₀还原为CoQ₁₀H₂[20]。因此，最终产品可能含有其中一种或两种氧化还原形式，从而形成复杂的分析场景。由于CoQ₁₀H₂在样品制备过程中非常不稳定且迅速氧化[21]，单独针对还原形式进行分析在常规分析中是不切实际的。因此，官方标准制定机构建议将所有形式转化为总CoQ₁₀含量进行测定。例如，AOAC和美国药典推荐使用三氯化铁（FeCl₃）作为分析氧化剂，将片剂和胶囊中存在的任何CoQ₁₀H₂转化为CoQ₁₀[22], [23], [24]。最近，中国国家标准（GB/T 22252-2024）发布，涵盖了七种不同的膳食补充剂基质[25]。然而，GB/T 22252-2024仅限于测定天然氧化形式，忽略了通过基质还原形成的CoQ₁₀H₂。此外，GB/T 22252-2024要求将软糖的提取溶剂从乙醇改为异丙醇。这种溶剂变更迫使实验室维护两条独立的校准曲线。因此，建立一个结合广泛基质覆盖和总氧化还原池量化的标准化工作流程仍然是一个未满足的需求。

为了解决这些限制，我们开发并验证了一种HPLC-DAD方法，用于测定七种常见膳食补充剂形式中的总CoQ₁₀含量。与现有的AOAC、USP和国家标准（如GB/T 22252-2024）相比，这项工作的主要优势在于建立了单一的提取和校准框架。现有框架在从传统剂型转换到复杂的亲水胶体基质时需要更换提取溶剂和校准曲线模型。相比之下，我们的方案可以在所有七种基质上实现单一的分析流程，无需更换溶剂或双重校准曲线，显著提高了常规QC的效率和实用性。方法开发包括系统优化色谱系统适用性、FeCl₃介导的氧化动力学以及特定基质的样品制备策略。具体而言，优化了测试样品的重量以消除软胶囊中的脂质干扰，并设计了一种专用的水溶解耦合液-液萃取程序来克服软糖中的乳化现象。该方法在特异性、线性、报告限值、准确性、精确度和提取稳定性方面经过了严格验证。最后，通过六个独立测试实验室的合作研究证明了其重现性和适用于常规QC转移的能力。

部分摘录

试剂和材料

CoQ₁₀的氧化形式（泛醌，98%）来自ANPEL-TRACE Standard Technical Services Co., Ltd.（中国上海）。CoQ₁₀的还原形式（泛醇，CoQ₁₀H₂，99.3%）来自美国药典（美国马里兰州罗克维尔）。无水乙醇（>99.7%）购自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（中国上海）。三氯化铁（FeCl₃, AR）和正己烷（≥98%）来自Aladdin（中国上海）。HPLC级甲醇由Tedia提供

色谱分离

鉴于CoQ₁₀的高亲脂性（log P = 21）[27]，其分离通常采用反相液相色谱法，这在中国国家标准（GB/T 22252-2024）[25]和AOAC方法[22,23]中都有规定。GB/T 22252-2024方法使用甲醇和无水乙醇作为流动相（55:45, v/v），而AOAC方法使用乙腈、四氢呋喃和水的混合物（55:40:5, v/v/v）。这符合常规测试要求

结论

已建立了一种经过验证的HPLC-DAD方法，用于测定七种主要膳食补充剂基质中的总CoQ₁₀（泛醌和泛醇之和）。该方案通过优化的FeCl₃氧化步骤成功解决了还原形式（CoQ₁₀H₂的化学不稳定性问题。通过将测试样品重量优化为0.1克，有效中和了软胶囊填充材料中的高脂基质干扰

作者贡献声明

王硕：研究、方法学、数据管理、资源提供、初稿撰写。陈一辉：研究、方法学、数据管理、初稿撰写。朱英倩：正式分析、验证。钱倩：正式分析、验证。雷美康：正式分析、验证。钟颖颖：正式分析、验证。曹国洲：概念构思、监督。王婷婷：概念构思、正式分析、资金获取、方法学、监督、写作审核

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

王硕：初稿撰写、资源提供、方法学、研究、数据管理。陈一辉：初稿撰写、方法学、研究、数据管理。朱英倩：验证、正式分析。钱倩：验证、正式分析。雷美康：验证、正式分析。钟颖颖：验证、正式分析。曹国洲：监督、概念构思。王婷婷：写作审核与编辑、监督、方法学、资金获取

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了中国宁波自然科学基金（项目编号2022J199和202003N4168）的支持。

王硕|陈一辉|朱英倩|钱倩|雷美康|钟颖颖|曹国洲|王婷婷