用于职业暴露评估的草甘膦与氨甲基膦酸多基质测定的集成LC-MS/MS工作流程

《Journal of Chromatography A》：An integrated LC-MS/MS workflow for multi-matrix determination of glyphosate and aminomethylphosphonic acid for occupational exposure assessment

　　

草甘膦和氨甲基膦酸（aminomethylphosphonic acid，AMPA）在四种生物和环境基质中得到了定量分析。所建立的免衍生化液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法仅需6分钟的分析运行时间。该工作流程可同时分析尿液、表面擦拭样品、贴片样品和OVS空气样品。该方法已应用于澳大利亚林业工人的1121份现场样本。该工作流程实现了职业性草甘膦暴露的综合评估。

草甘膦与氨甲基膦酸多基质测定集成LC-MS/MS工作流程用于职业暴露评估的论文解读

**研究背景与目的**

草甘膦是全球使用最广泛的除草剂之一，在农业、园艺和林业中应用广泛。尽管林业在全球草甘膦使用量中所占比例低于农业，但含草甘膦除草剂仍是国际林业中主要的杂草控制产品，对于立地准备、植被管理和可持续人工林生产至关重要。然而，草甘膦的潜在毒性，尤其是其致癌性以及含有多种助剂的商业制剂的毒性，仍引发持续关注。草甘膦类除草剂的广泛使用导致对混合、装载和喷洒活动中工人职业暴露的担忧日益增加。职业暴露可能通过多种途径发生，包括吸入、皮肤吸收以及接触污染表面后的无意摄入。欧洲食品安全局（EFSA）已设定了可接受操作者暴露水平（AOEL）为0.1 mg kg?1体重天?1，澳大利亚农药和兽药管理局（APVMA）设定了每日可接受摄入量（ADI）为0.3 mg kg?1体重天?1。然而，国际公认的职业空气暴露限值和生物监测指导值仍然有限。此外，关于草甘膦类除草剂职业暴露的数据相对较少，尤其是在林业环境中，暴露水平可能因喷洒方法、环境因素和工作实践而有很大差异。草甘膦的初级降解产物氨甲基膦酸（AMPA）也与暴露评估相关，但人体中检测到的AMPA来源及其毒理学意义尚不完全清楚。由于草甘膦和AMPA具有高极性、亲水性、两性、低挥发性、低分子量且缺乏发色团或荧光团，其准确测定在分析上具有挑战性。传统反相色谱条件下保留较差，衍生化策略通常费时费力，离子对色谱可能损害系统稳定性，而离子色谱则需要专用仪器。亲水相互作用色谱（HILIC）为无需衍生化直接分析高极性化合物提供了有力工具，但草甘膦和AMPA因与金属离子螯合的强烈倾向，仍常出现峰形差和灵敏度低的问题。目前，大多数已发表的方法针对单一生物或环境基质开发，通常需要特定基质的样品制备或衍生化步骤。因此，迫切需要一种统一的、免衍生化、高通量的分析工作流程，用于测定与职业暴露评估相关的多种生物和环境基质中的草甘膦和AMPA。

**研究内容与结论**

本研究旨在开发并验证一种稳健的多基质LC-MS/MS方法，用于同时测定尿液、表面擦拭、贴片和OVS空气样品中的草甘膦和AMPA，并证明其在林业环境中综合职业暴露评估中的适用性。研究人员系统优化了色谱条件、样品制备程序，并进行了全面的方法学验证。该方法成功应用于澳大利亚昆士兰州、维多利亚州、西澳大利亚州和塔斯马尼亚州林业承包商喷洒活动期间采集的1121份现场样本，包括165份尿液、756份贴片、140份表面擦拭和60份呼吸区空气样本。结果表明，该方法在6分钟分析时间内实现了四种基质中两种分析物的灵敏、准确测定，无需衍生化。尿液样本中，草甘膦在78%的样本中高于定量下限（LLOQ），几何均值为7.30 ng mL?1；AMPA检出率为21%，几何均值为1.60 ng mL?1。环境基质中，草甘膦在所有贴片、表面擦拭和OVS样本中均有检出，几何均值分别为6.54 μg、116 μg和198.9 ng。该方法展现了良好的稳健性和高通量适用性，为林业工人职业暴露评估提供了集成分析平台。相关成果发表在《Journal of Chromatography A》。

**主要关键技术方法**

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，选用混合模式HILIC Obelisc N色谱柱，结合含甲酸的水-乙腈流动相，实现草甘膦和AMPA的无需衍生化色谱分离；其次，通过在样本中加入亚甲基二膦酸（MA）来减轻金属螯合效应，显著改善峰形和信号强度；第三，尿液样本采用AFFINIMIP分子印迹聚合物（MIP）固相萃取（SPE）柱进行选择性净化，而表面擦拭、贴片和OVS样本则采用统一的水提取流程；第四，使用稳定同位素标记内标（glyphosate-¹³C₂, ¹⁵N和AMPA-¹³C, ¹⁵N）进行校正；最后，在SCIEX 4500三重四极杆质谱仪上以电喷雾电离负离子模式和多反应监测（MRM）模式进行检测。样本来自澳大利亚四个州的林业工人。

**研究结果**

**LC-MS/MS条件的优化**：研究人员系统评估了MA的引入方式（系统钝化与样本内添加）和浓度。结果显示，在不添加MA时，草甘膦表现出显著峰拖尾和低信号强度；在样本中添加0.1 mmol L?1 MA即可显著改善峰形和灵敏度，更高浓度无额外增益且可能引入污染。等度洗脱条件（80%溶剂A和20%溶剂B）提供了最佳峰形和信号强度，故被采用。

**样品制备程序的优化**：尿液样本制备中，比较了稀释法、两步SPE（MCX+MAX）和MIP SPE。稀释法灵敏度不足；两步SPE尽管经优化，基质效应仍约为30%，回收率低（草甘膦约21%，AMPA约11%）；而AFFINIMIP MIP SPE在pH 8上样条件下获得最佳综合提取效率，草甘膦和AMPA的过程效率分别达52%和21%，较两步SPE有实质改善。对于表面擦拭、贴片和OVS样本，建立了统一的水提取方案，无需SPE、蒸发、复溶或衍生化步骤。

**方法学验证**：在尿液和溶剂中评估了特异性、线性、LOD、LLOQ、准确度、精密度、基质效应、回收率、残留和稳定性。尿液基质中草甘膦和AMPA的LOD分别为0.1和0.2 ng mL?1，LLOQ分别为0.3和0.5 ng mL?1。尿液中的IS归一化基质因子为85.9%–95.7%，IS归一化回收率为94.8%–102.2%。表面擦拭、贴片和OVS样本的加标实验显示准确度和精密度均在可接受范围内，支持使用溶剂校准曲线。未观察到残留，稳定性评估显示在测试条件下分析物稳定。

**与已发表方法的比较**：与代表性已发表方法相比，本研究方法的独特之处在于无需衍生化即可在单一LC-MS/MS平台上实现四种基质（尿液、表面擦拭、贴片和OVS空气样本）的同时测定，6分钟的分析时间支持高通量分析。尽管某些单基质方法通过高度优化可实现更低LLOQ，本方法在多种基质中提供了足够的灵敏度，同时避免了衍生化和基质特异性制备的复杂性。

**方法应用**：该方法成功应用于1121份林业工人现场样本的分析。所有分析批次均满足FDA生物分析方法验证指南的接受标准。暴露评估结果显示，尿液样本中草甘膦检出率78%（GM：7.30 ng mL?1），AMPA检出率21%（GM：1.60 ng mL?1）；环境样本中草甘膦在所有样本中均有检出，AMPA在超过87%的样本中检出。该结果与新西兰农民的职业生物监测数据相当，证实了方法的实用性。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究开发的集成LC-MS/MS工作流程解决了现有方法中生物监测与环境监测脱节的问题，通过单一平台实现了多基质同时分析，显著提高了分析效率。在样本中添加MA的策略简单有效，避免了金属螯合导致的峰形恶化和灵敏度损失，且无需衍生化步骤。MIP SPE在复杂尿液基质中展示了优于传统两步SPE的净化效果。研究表明，尿液AMPA检出率和浓度低于草甘膦，与先前职业生物监测研究一致，提示AMPA可能并非草甘膦暴露的理想生物标志物，其来源和毒理学意义仍需进一步研究。环境基质中草甘膦和AMPA的高检出率凸显了多途径暴露评估的重要性。

研究结论部分总结道：本研究采用双重样品制备策略，结合选择性SPE净化（尿液）和简化的通用提取方法（环境基质），实现了单一LC-MS/MS平台上6分钟运行时间的高通量多基质分析。样本内MA添加提供了一种简单而稳健的策略来减轻金属诱导效应，改善灵敏度和色谱性能，无需衍生化。该方法成功应用于澳大利亚林业工人超过一千份现场样本，展现了其在职业暴露评估中的稳健性和实际适用性。产生的多基质数据为职业暴露水平提供了有价值的信息，可能支持未来研究不同暴露途径的相对贡献，从而改善林业环境中的暴露表征和风险缓解策略。