宿主诱导的Minc09294效应基因沉默损害南方根结线虫和象耳豆根结线虫的侵染

《Pest Management Science》：Host-induced silencing of the Minc09294 effector gene impairs Meloidogyne incognita and M. Enterolobii infection

　　

根结线虫（root-knot nematode, RKN）南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是全球最重要的植物寄生线虫（plant-parasitic nematode, PPN）之一。M. incognita分泌大量效应蛋白，通过调节宿主易感性在寄生中发挥主要作用。在本研究中，研究人员利用宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing, HIGS）方法在转基因植物中功能鉴定了M. incognita的Minc3s00280g09294（Minc09294）基因作为推定效应因子。定量表达分析表明，Minc09294基因从卵到J4阶段弱表达，但在植物寄生过程中于成年雌虫中强烈诱导，提示其在固着取食阶段发挥作用。计算机域预测显示，编码的Minc09294蛋白含有四个半乳糖凝集素/半乳糖结合凝集素结构域、一个用于细胞外分泌的N端信号肽、一个非细胞质区域，且无预测跨膜结构域，与分泌到宿主组织中的特性一致。与野生型植物相比，在Minc09294-RNAi株系中，宿主植物中的Minc09294沉默显著减少了虫瘿数（92.9%）、卵块数（93.5%）、卵数（79.0%）和线虫繁殖因子（90.5%）。组织学分析进一步显示，Minc09294-RNAi株系中的虫瘿较小，巨细胞发育不良。由于象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）中的同源基因ME_e1834_066g0351951与Minc09294具有高度序列相似性，因此也与RNAi靶序列相似，研究人员还用M. enterolobii攻击了Minc09294-RNAi株系。这些Minc09294-RNAi株系在虫瘿数（最多减少53.7%）和卵块数（最多减少53.3%）上表现出显著降低，而对卵数和繁殖因子的影响较不明显。总的来说，这些数据表明M. incognita中的Minc09294及其在M. enterolobii中的同源基因ME_e1834_066g0351951是成功寄生所必需的，并代表了基于RNAi的持久控制RKN的有前景的效应靶标。

**研究背景与科学问题**
植物寄生线虫（PPN）是极具破坏性的农业害虫，全球年经济损失估计超过65亿美元。根结线虫（RKN）中，南方根结线虫（Meloidogyne incognita）经济重要性最为突出，尤其在巴西等地严重危害大豆和棉花等作物。RKN侵染维管根时，依赖分泌大量效应蛋白来克服寄主抗性，这些效应蛋白主要在食道腺细胞中合成，也由其他分泌器官贡献。在亲和互作中，效应蛋白被释放到寄主细胞质或质外体，抑制植物免疫、修饰细胞壁、重编程维管细胞形成巨细胞（GC），以建立固着寄生。尽管已预测出M. incognita食道腺特异效应蛋白486个，但功能验证的不足6%。宿主诱导的基因沉默（HIGS）通过转基因植物表达双链RNA（dsRNA）产生小干扰RNA（siRNA），特异沉默线虫靶基因，已成为提高植物抗性的有前景策略。此前已有多个效应基因被验证为HIGS靶标，如Minc16D10、Mi8D05等，但许多候选效应基因的功能仍不清楚。Minc09294（Minc3s00280g09294）在前期转录组数据中显示在接种后22天（DAI）的虫瘿中表达，雌虫期显著上调，且其编码蛋白具有分泌信号肽、多个半乳糖凝集素结构域、无跨膜域，提示其可能作为效应蛋白参与寄生。然而，该基因是否真正参与寄生以及能否作为HIGS靶标尚属未知。为此，本研究旨在功能鉴定Minc09294，并评估基于HIGS的沉默对M. incognita和亲缘种象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）侵染的影响。

**主要技术方法**
研究人员从WormBase ParaSite数据库（BioProject PRJEB8714）获取Minc09294及其同源基因序列，使用InterProScan、SignalP 5.0、TMHMM、DeepLoc-2.1等工具预测蛋白结构域、信号肽、跨膜域及亚细胞定位；利用MERCI鉴定效应蛋白富集基序；通过MEGA12.1构建系统发育树。表达分析基于已有转录组数据（Grynberg et al., 2020）和RT-qPCR（以Actin和GAPDH为内参，2^?ΔΔCt法）检测各发育阶段及虫瘿中的表达。HIGS载体包含Minc09294基因300 bp片段，以正向和反向重复形式克隆于PDK内含子两侧，由pUces8.3启动子驱动；阳性对照为Minc16D10（129 bp片段）。通过农杆菌介导叶盘法转化烟草（Nicotiana tabacum var. Petit Havana SR1），获得T3代纯合转基因株系。线虫接种试验以番茄繁殖的M. incognita和M. enterolobii制备预寄生二期幼虫（ppJ2），每株接种1000头，60 DAI统计虫瘿数、卵块数、卵数、繁殖因子（Oostenbrink公式）和虫瘿直径。组织学分析采用Technovit树脂包埋切片，甲苯胺蓝染色后光镜观察。

**研究结果**
**3.1 Minc09294基因序列分析**
Minc09294基因全长约7.13 kb，含14个外显子和12个内含子，编码672个氨基酸的蛋白（分子量74.3 kDa，等电点8.7）。蛋白预测具有N端信号肽（第1–22位残基）、四个半乳糖凝集素/半乳糖结合凝集素结构域、一个非细胞质区域及两个MERCI基序，无跨膜域、无核定位信号，符合分泌性效应蛋白特征。同源检索发现6个旁系同源基因（如Minc3s01978g27554等）及M. enterolobii中的两个直系同源基因ME_e1834_066g0351951和ME_e1834_073g0363811。系统发育分析显示ME_e1834_066g0351951与M. incognita旁系同源基因聚在支持度高的分支，且与M. arenaria同源基因紧密聚类。转录组数据表明Minc09294在雌虫中表达最高，卵、J2、J3期表达中等；RT-qPCR确认其在烟草虫瘿中于22 DAI（雌虫期）强烈上调，提示其参与固着取食阶段。

**3.2 过表达HIGS构建体的转基因植株**
通过农杆菌介导转化，成功获得携带HIGS构建体的烟草转基因株系。T0代经卡那霉素筛选，T1–T3代经草铵膦喷洒和PAT/bar基因PCR检测，获得纯合株系。三种独立Minc09294-RNAi株系和三种Minc16D10-RNAi对照株系均未表现多效表型。

**3.3 HIGS靶向Minc09294降低烟草对M. incognita的易感性**
接种M. incognita后，Minc09294-RNAi株系与野生型相比，每克根虫瘿数减少81.5%–92.9%，卵块数减少80.3%–93.5%，卵数减少61.3%–79.0%，繁殖因子降低67.2%–90.5%，虫瘿直径显著减小。RT-qPCR显示寄生期间Minc09294转录本水平最多降低85.33%，表明HIGS有效沉默靶基因。Minc16D10-RNAi阳性对照株系表现出类似程度的易感性降低。由于Minc09294与M. enterolobii的ME_e1834_066g0351951基因序列同一性达92.06%，研究人员用M. enterolobii接种Minc09294-RNAi株系，发现虫瘿数减少36.3%–53.7%，卵块数减少36.9%–53.3%，但卵数和繁殖因子无显著差异；ME_e1834_066g0351951转录本降低50.76%，低于Minc09294自身的沉默效率，可能因HIGS靶序列与ME_e1834_066g0351951的同一性仅为93.03%。

**3.4 M. incognita诱导虫瘿的组织学分析**
非转基因植株根部呈现大型、融合、多虫瘿，而Minc09294-RNAi和Minc16D10-RNAi株系虫瘿小、简单且孤立。光镜观察显示，非转基因虫瘿内有多个发育良好的取食位点，含成熟线虫、大量巨细胞，皮层破裂，维管扩张；而Minc09294-RNAi株系虫瘿发育延迟，巨细胞数量少、细胞质减少、细胞壁薄、常无可见核，并出现空巨细胞和未产卵块。统计显示Minc09294-RNAi株系虫瘿平均直径为202.31 μm，较野生型468.45 μm减少43.18%。M. enterolobii在非转基因根上可形成多达5个取食位点，而转基因株系最多2个且虫瘿更小，表明HIGS对两种线虫均能延缓取食位点形成。

**讨论与结论**
本研究表明Minc09294是M. incognita寄生成功所必需的效应基因，其沉默效果与已验证的Minc16D10相当。Minc09294蛋白含半乳糖凝集素结构域，这类糖结合蛋白在寄主-病原互作中具有重要作用，推测其可能通过与寄主糖类或糖蛋白互作促进寄生，但具体互作网络尚待阐明。交叉沉默实验证实Minc09294-RNAi株系对M. enterolobii也具抗性，说明直系同源基因ME_e1834_066g0351951在M. enterolobii中功能类似，两者均可作为RNAi控制RKN的候选靶标。结合已有研究，HIGS靶向多个效应基因可增强控制效果和持久性。本研究将Minc09294及其同源基因确立为寄主-线虫互作中的关键效应因子，为开发基于RNAi的广谱抗根结线虫作物提供了理论依据和实践靶点。