CRISPR/Cas9介导的LbSP1与LbSP5G1敲除揭示黑果枸杞枝条构型的高效定制

《Plant Biotechnology Journal》：CRISPR/Cas9-Mediated Knockout of LbSP1 and LbSP5G1 Reveals Efficient Customization of Shoot Architecture in Black Goji Berry

　　

枸杞（goji）被认为是一种营养丰富的超级水果，具有药用与工业价值。然而其固有的无限生长习性导致开花不同步与果实成熟不均，造成收获效率低下、劳动力成本高及产量低。为阐明枝条决定性（shoot determinacy）与早花分子基础，研究人员对宁夏枸杞（Lycium barbarum）F1杂交群体中无限与有限枝条顶端的比较转录组分析鉴定出15个与生长终止和早花相关的候选基因，包括一个SP样基因（LbSP1，Lba0102749）和一个番茄SlSP5G的枸杞同源基因（LbSP5G1，Lba0501086），二者均属磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）家族。在黑果枸杞（black goji berry）中CRISPR/Cas9介导敲除LbSP1与LbSP5G1获得了纯合单突变（CRLbSP1、CRLbSP5G1）与双突变（2gCR LbSP1+LbSP5G1）有限生长株系，表现为紧凑枝构、降低的日长敏感性、顶端开花及改善的果实产量。双突变株系首花序前叶片数显著降至7.25（野生型WT为18.6），单株果产量174.94 g，次之CRLbSP5G1（64.55 g）、CRLbSP1（55.17 g）与WT（22.09 g）。转录组与共表达分析揭示开花调控网络广泛重编程，LbSP1与LbSP5G1作为中枢调控枢纽发挥作用。蛋白互作实验进一步确立两基因在PEBP中心网络中的功能分化。该研究首次在枸杞中功能表征顶端开花基因，为选育适应机械化收获的紧凑、早花、高产品种提供分子框架。

研究背景方面，枸杞（Lycium barbarum L.）为茄科落叶木本多年生植物，因无限生长习性导致同株花果并存、成熟期长达数月，宁夏产区6至10月需每周人工采收，劳动力密集且与其它农事冲突，制约产业化。尽管田间已发现顶端开花有限生长种质，但枸杞生长习性调控的分子基础长期未被剖析。PEBP家族的CEN-TFL1-SP（CETS）亚家族在模式与作物中保守控制分生组织命运，番茄sp突变体即表现为顶端开花与紧凑株型，为枸杞定向育种提供理论参照。本研究依托枸杞F₁杂交群体（母本JiamengQi1×父本Zhongkelüchuan1），以转录组导向定位候选基因，并在近缘可转化种黑果枸杞（Lycium ruthenicum）中CRISPR/Cas9验证，发表于《Plant Biotechnology Journal》。

主要关键技术方法概括：研究人员以宁夏枸杞F₁群体中选出的无限顶端（N）、有限顶端终止前（TB）与终止后（TA）三类顶芽为材料，进行扫描电镜（SEM）形态观察与RNA-seq转录组测序；通过DESeq2筛选差异表达基因（DEG）并经GO/KEGG富集锁定PEBP家族LbSP1（Lba0102749）与LbSP5G1（Lba0501086）；基于枸杞序列设计gRNA，在黑果枸杞中由农杆菌EHA105介导CRISPR/Cas9单/双靶编辑，T0代获纯合无转基因编辑株；结合RT-qPCR、S1果与茎尖分生组织（SAM）转录组、WGCNA共表达模块分析、酵母双杂（Y2H）与萤火虫荧光素酶互补成像（LCI）解析蛋白互作。

研究结果部分，3.1节扫描电镜显示无限枝顶螺旋叶序、8至10叶后腋生花序，有限枝顶早期缩小、顶端转向花序并单花终结，证实形态分化。3.2节转录组在N/TB/TA九样本中获得8154个DEG，PEBP等液泡与DNA结合类显著富集。3.3节从44个高置信候选收窄至15个，其中LbSP1因与番茄SlSP同支、LbSP5G1因近SlSP5G被选为编辑靶标。3.4节CRISPR/Cas9在黑果枸杞获92.86%编辑率，纯合无载体整合；表型上双突变首花序叶数约5至6片、单株产174.94 g，单突变次之，WT仅22.09 g，且双突变为最紧凑顶端开花。3.5节编辑株SAM与S1果转录组显示MADS-box、MYB、WUS、SPL、FT样等广受抑，WGCNA红模块以LbSP5G1为枢纽、灰模块含LbSP1与WUS；Y2H/LCI中LbSP5G1直接结合DELLA1、MADS-box、MYB、DOF1，LbSP1仅植体中间接弱互作，揭示二者在PEBP网络功能分化。

讨论与结论翻译总结：研究人员指出无限转有限生长由PEBP中枢整合光周期与环境信号，番茄sp范式在枸杞近缘成功复现。双敲除同步消除日长敏感与顶端优势，使同枝果熟同步化，直接回应机械化采收瓶颈。讨论强调LbSP1偏维持分生组织同一性、LbSP5G1偏花期抑制解除，二者叠加产生超亲紧凑早花表型，为茄科有限生长调控补充枸杞证据。结论为：CRISPR/Cas9敲除LbSP1与LbSP5G1首次在枸杞属功能界定顶端开花基因，建立枝条构型定制分子框架，双突变线产效最优，可作高密度栽培与机械收获育种底盘。