《npj Drug Discovery》：Pushing the boundaries of virtual screening scale of combinatorial spaces with the V-SYNTHES approach
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计算筛选十亿（giga）级化学空间为高质量苗头（hit）识别提供了一条经济高效的路径，并为药物发现提供切入点。随着此类按需（on-demand）空间的增长与成功应用增多，诸如CACHE挑战赛（Critical Assessment of Computation
计算筛选十亿（giga）级化学空间为高质量苗头（hit）识别提供了一条经济高效的路径，并为药物发现提供切入点。随着此类按需（on-demand）空间的增长与成功应用增多，诸如CACHE挑战赛（Critical Assessment of Computational Hit-Finding Experiments）等严格盲评基准为计算工具提供了重要性能指标。研究人员在此报道了V-SYNTHES2合成子筛选法在1730亿化合物Enamine xREAL空间中的首次应用，该空间较此前基准扩展16倍，显示出近乎线性的计算扩展特性，相较110亿化合物的REAL空间成本仅增加10–15%。研究人员在CACHE挑战赛#2（靶向SARS-CoV-2 NSP13的RNA结合位点）与CACHE挑战赛#4（靶向CBLB的酪氨酸激酶结合域）中应用该工作流，两口袋均缺乏既定药理学基础，属极端苗头发现挑战。在盲态独立验证条件下，V-SYNTHES2位列最优提交之一：NSP13的8%命中率超过2.3%的领域均值并居前三位工作流；CBLB中亦识别出1个满足预定命中标准的化合物。结果表明V-SYNTHES2在配体匮乏靶点的十亿级规模下保持稳健性能，恰是数据驱动方法面临根本局限的条件，并为百千亿化合物空间的合成子筛选建立了定量性能基线。
研究背景方面，结构基虚拟筛选（SBVS）已成为早期药物发现中高通量筛选的成功替代方案，但随虚拟化学空间扩张至数十亿乃至万亿分子，暴力分子对接（brute-force molecular docking）在算力与时间上逼近极限。现有自适应筛选如VirtualFlow、主动学习（AL）及深度学习对接（DiffDock、AlphaFold-3、Boltz-2）仍受限于训练数据、显式枚举成本与泛化能力，尤其在无既定药理学的配体匮乏靶点上表现受限。为此，研究人员基于V-SYNTHES2合成子筛选框架，探究其在化学空间扩大16倍至1730亿化合物（Enamine xREAL空间）时是否维持计算效率、能否在盲评下识别无药理学靶点确证苗头、以及合成子模块化是否支持苗头扩展与构效关系（SAR）探索。
主要关键技术方法包括：采用V-SYNTHES2流程，先构建代表所有唯一合成子-骨架组合的最小枚举库（MEL）并对片段对接；按打分与RTCNN（Radial and Topological Convolutional Neural Network）阈值过滤后迭代枚举为约100万全分子再对接；经PAINS、Lipinski五规则、毒性/反应性过滤及基于合成子的聚类，专家目视检查择百化合物交Enamine合成；样本来自CACHE#2（NSP13，选用PDB 5RLZ晶体结构）与CACHE#4（CBLB，选用PDB 8GCY晶体结构）公开队列；实验验证分别用表面等离子共振（SPR）/ATP酶抑制（NSP13）与荧光偏振（FP）及SPR计数器筛（CBLB）。
研究结果部分，“Scale of the V-SYNTHES approach”表明xREAL空间含103879构筑块与165反应，1730亿分子中1710亿来自三组分反应；V-SYNTHES2成本仅较110亿REAL空间增10–15%，因MEL由659000增至200万但仍为低旋转键片段。“Selection of SARS-CoV-2 NSP13 structural model”通过对5RLH、5RLZ、5RMM共晶片段重对接选5RLZ（RMSD约2.0与1.6 ?，羧基与N516保守氢键）。“V-SYNTHES2 screening for candidate binders to SARS-CoV-2 NSP13”经MEL对接、枚举、多假设结合模式分组与合成子聚类，自9万初筛缩至约3千候选，专家审1000姿态择100化合物，77%合成成功。“Characterization of new SARS-CoV-2 NSP13 ligands”中SPR测定77合成物，6个确证苗头Kd 7–43 μM，命中率8%，超CACHE#2均值2.3%进前三，Tanimoto相似度<0.4相对ChEMBL。“Limited hit expansion of initial V-SYNTHES2 hits for SARS-CoV-2 NSP13”对4系列作第二轮32类似物合成（43%成功率），仅CACHE2_1418_52系列4个与CACHE2_1418_68系列1个保持48–189 μM结合，未见优效但揭示酰基直接连芳杂环与para位氮重要。“Applying the V-SYNTHES2 workflow to CBLB”以8GCY建模型（AUC 96%，重对接一致）。“Selection and synthesis of candidate hits for CBLB”筛得69合成（77.5%成功率）。“Characterization of new CBLB ligands”中FP初筛69物，1个CACHE4HI_1955_60 Kd 111.9 μM达标且对GID4无活性。“Limited hit expansion of initial V-SYNTHES2 hits”作26类似物中13合成，全部失活；最近似物meta位氮取代para位破坏与S368氢键证伪活性。
讨论部分总结：研究确立三发现——V-SYNTHES2扩至1730亿仅增成本10–15%（MEL架构隔离总对接量）；NSP13盲评8%居前三、CBLB获1确证苗头，证明物理基评分在无配体数据靶点可行，而ML法受训限；CACHE独立验证免除了自验偏倚。作者指出xREAL对首轮命中覆盖强但脚手架分布不均、构筑块可得性限制SAR；CBLB苗头para氮至meta氮位移即失活显示窄SAR最优点；未来可将V-SYNTHES2合成子效率与主动学习结合，并引入十亿级MADE（make-on-demand）构筑块拓焦库。
结论译文：本工作确立了超越既往V-SYNTHES2框架的三项发现。其一，该方法扩展至1730亿化合物（化学空间16倍扩增）仅伴10–15%计算成本上升，此系MEL架构使总对接努力不受库容增长影响的直接后果。其二，NSP13确证命中率8%大幅超越CACHE#2平均2.3%，使V-SYNTHES2居前三工作流；CBLB中识别1个满足预定FP标准化合物（Kd=111.9 μM）并推进苗头扩展，证明在无先存药理学靶点上可靠，恰为数据驱动法局限最大处。其三，经CACHE基础设施独立实验验证提供高置信性能基准，免除了自验计算研究可能有的事后选择偏倚。
